高效液相色譜法演示文稿

高效液相色譜法()演示文稿1當前1頁，總共62頁。2（優(yōu)選）高效液相色譜法()當前2頁，總共62頁。第1節(jié)高效液相色譜儀當前3頁，總共62頁。HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作；還會影響檢測器的正常響應。一、輸液系統(tǒng)（一）溶劑脫氣與過濾①抽真空脫氣②超聲波振蕩脫氣③吹氦脫氣溶劑應經過0.45μm濾膜過濾，以除去溶劑中的固體雜質，防止堵塞色譜柱、管路系統(tǒng)，保護高壓泵當前4頁，總共62頁。（二）高壓輸液泵對輸液泵的基本要求：

①流量準確可調。流動相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常要求小于±0.5%。②耐高壓。通常要求泵的輸出壓力達到30-60MPa的高壓。③液流穩(wěn)定。輸出的液流應無脈動④泵的死體積小。泵的死體積通常要求小于0.5mL。⑤密封性能好，耐腐蝕當前5頁，總共62頁。輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵，恒流泵的應用更廣泛。當前6頁，總共62頁。（三）梯度洗脫裝置等度洗脫：用恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫，方法簡便、色譜柱易再生等是其優(yōu)點。

梯度洗脫：在一個分析周期內，按一定程序不斷改變流動相的配比，逐步提高洗脫強度。梯度洗脫可以使一個復雜樣品中性質差異較大的組分，都能在各自適宜的分離條件下分離。

梯度洗脫的特點：①縮短分析周期；②提高分離效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加檢測靈敏度。⑤基線漂移及重復性不佳當前7頁，總共62頁。等度洗脫與梯度洗脫（弱）（強）A→B（弱→強）當前8頁，總共62頁。高壓梯度（外梯度）:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱低壓梯度（內梯度）:一臺高壓泵,通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。當前9頁，總共62頁。二、進樣系統(tǒng)進樣器要求密封性好，死體積小，重復性好。

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，結構如圖所示：當前10頁，總共62頁。三、分離系統(tǒng)使用色譜柱注意事項：1溶劑和樣品應過濾，防止堵塞。2加前置柱。3用完后要清洗

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm，當前11頁，總共62頁。四、檢測系統(tǒng)要求檢測器靈敏度高、噪聲低、死體積小、線性范圍寬、重復性好、適用范圍廣等。（一）紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。當前12頁，總共62頁。紫外檢測器包括固定波長、可變波長和光電二極管陣列檢測器當前13頁，總共62頁。1024個二極管陣列10ms完成一次檢測，1s采集100000個含吸光度、波長、時間的數(shù)據(jù)，得到一張吸光度、波長、保留時間的三維色譜圖。當前14頁，總共62頁。

靈敏度高；線性范圍寬；流通池可做得很小(1mm×10mm，容積8μL)；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。特點：（二）熒光檢測器

高靈敏度，高選擇性。對多環(huán)芳烴，維生素B，黃曲霉素，卟啉類化合物，農藥，藥物，氨基酸，甾類化合物等有響應。當前15頁，總共62頁。當前16頁，總共62頁。（三）示差折光檢測器

通用型檢測器，但靈敏度低，對溫度敏感，不能用于梯度洗脫

可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度成正比。當前17頁，總共62頁。（四）蒸發(fā)光散射檢測器

這種檢測器可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分的檢測，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度較低，主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸及甾體等幾十類化合物。

在一定的條件下，光散射強度正比于溶質粒子的大小和數(shù)量。散射光強度與樣品微粒質量的關系為

I=kmb式中，m為微粒質量，k、b為實驗條件（如溫度、流動相性質）決定的常數(shù)。因此可根據(jù)散射光強度對樣品進行定量分析。當前18頁，總共62頁。當前19頁，總共62頁。五、數(shù)據(jù)記錄處理和計算機控制系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)又稱色譜工作站：它可對分析全過程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進行在線顯示，自動采集、處理和儲存分析數(shù)據(jù)。當前20頁，總共62頁。第2節(jié)基本理論高效液相色譜法的塔板理論與氣相色譜法完全相同，速率理論略有差異。一、柱內展寬1.渦流擴散項渦流擴散項與氣相色譜法相同，

A＝2λdp

高效液相色譜多使用3～10um球形固定相顆粒,以均漿高壓裝填，A較小。當前21頁，總共62頁。2.分子擴散項3.流動相傳質阻力項

流動相傳質阻力，實際包括兩方面，一是移動流動相傳質阻力Hm，二是滯流（靜態(tài)）流動相傳質阻力Hsm。組分在液體中的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中,B/u很小，可忽略不計。當前22頁，總共62頁。當前23頁，總共62頁。a.移動流動相傳質阻力（Cmu）當流動相在色譜柱內流動時，離固定相較遠的組分流動較快，處于固定相顆粒表面的組分流動較慢，由于這種差別，會使組分的色譜峰擴展.展寬大小與固定相顆粒直徑平方成正比，與流動相線速度成正比，與組分在流動相中的擴散系數(shù)Dm成反比：b.滯流流動相傳質阻力（Csmu）當前24頁，總共62頁。當前25頁，總共62頁。

流動相在色譜柱中流動時，有部分流動相進入到多孔的固定相深孔中，滯留后難以流動。組分分子進入滯留區(qū)造成色譜峰擴展，使柱效降低，4.固定相傳質阻力項（Csu）

組分分子在固定液中傳質時，因所受到的阻力不同而引起色譜峰擴展

在鍵合相色譜法中，df很?。▎畏肿訉樱?，固定相傳質阻力可以忽略。當前26頁，總共62頁。在高效液相色譜中，范第姆特方程可寫成：

H＝A+Cu＝A+Cmu+Csmu

隨著u的增大，H增大，柱效降低，故其最佳流速就在u很小的地方。當前27頁，總共62頁。為了減小柱內展寬，提高柱效，可采取以下措施：(1)用小而均勻的球形固定相，填充均勻，以減少渦流擴散。（2）使用低粘度的小分子溶劑作流動相，減小流動相傳質阻力；(3)流動相的流速低，一般控制在1mL/min左右二、柱外展寬（4）柱溫25℃左右為宜。柱溫太高，雖Dm增大，傳質阻力減小，但易產生氣泡，太低不僅減小Dm，使傳質阻力增大，而且流動相的粘度增大，柱阻加大。當前28頁，總共62頁。采用小體積檢測器，管道對接宜呈流線形，減少柱外死體積，從而減小柱外展寬，提高柱效。

從進樣器到檢測器之間，除色譜柱以外，其它因素導致的譜峰展寬。當前29頁，總共62頁。HPLC

高效液相LSC

液固LLC液液IEC離子交換SEC空間排阻AC親和色譜IC離子色譜BPC化學鍵合相NPBPC正相—RPBPC反相—PIC離子對ISC離子抑制第3節(jié)各類高效液相色譜法當前30頁，總共62頁。一、吸附色譜法

固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑.有時也用高分子多孔小球（吸附+分配并兼有小孔凝膠作用）

以固體吸附劑為固定相，基于其對不同組分吸附能力的差異進行混合物的分離。流動相：常用混合溶劑，主體溶劑為正己烷或環(huán)己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作為調節(jié)劑，用于調整流動相的極性。當前31頁，總共62頁。a.表面多孔型b.無定形全多孔c.球形全多孔d.堆積全多孔應用：主要用于分離能溶于有機溶劑的極性與弱極性混合物及異構體的分離。二、化學鍵合相色譜法以化學鍵合相為固定相的色譜法稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法。強極性組分后出峰，弱極性組分先出峰當前32頁，總共62頁。（一）化學鍵合固定相用化學反應的方法將有機分子鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學鍵合固定相，簡稱鍵合相。化學鍵合相已廣泛用于正相與反相色譜法、離子對色譜法等諸多色譜法中。1、鍵合反應化學鍵合相的載體是硅膠，表面有≡Si—OH，能與合適的有機化合物反應，使具有不同極性功能團的有機分子鍵合在表面而獲得不同性能的化學鍵合相，它的制備方法主要是用有機氯硅烷與硅醇基發(fā)生反應（硅烷化），生成Si-O-Si-C鍵合相。

當前33頁，總共62頁。由于空間位阻效應，不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反應。

殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性，使組分的峰形拖尾。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要用小分子三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，稱封尾。當前34頁，總共62頁。當前35頁，總共62頁。2.鍵合相的分類（1）非極性鍵合相

這類鍵合相表面基團為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基與苯基等。十八烷基鍵合相（ODS）是最常用的非極性鍵合相。當前36頁，總共62頁。1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯固定相：C1固定相：C8固定相：C18非極性鍵合相常用于反相色譜。鍵合烷基的鏈長增加，極性降低，載樣量增大、k值增大，C18分離效果優(yōu)于C8,C1當前37頁，總共62頁。（2）中等極性鍵合相

中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相（如YWG-ROR′）。這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。（3）極性鍵合相常用氨基、氰基鍵合相。分別將氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]及氰乙硅烷基[—Si(CH2)2CN]鍵合在硅膠上而制成。它們可用作正相色譜的固定相。（4）離子交換鍵合相離子交換基團如-SO3－，-NR3＋鍵合在擔體表面。當前38頁，總共62頁。3.鍵合相的性質

（1）穩(wěn)定性鍵合相在pH2-8.5范圍內穩(wěn)定，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。（2）鍵合量鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，按含碳量的不同，可分為高碳、中碳及低碳型鍵合相。當前39頁，總共62頁。高碳ODS鍵合相：若R1、R2是二個甲基，構成高碳ODS鍵合相

［Si-O-Si(CH3)2-C18H37］。

中碳ODS鍵合相：若R1是氫，R2是氯，氯與硅膠的另一個硅醇基脫HCl，則生成中碳ODS鍵合相

［（Si-O-)2Si(H)-C18H37］；低碳ODS鍵合相：若R1、R2都是氯，與硅膠的另二個硅醇基再脫二分子HCl，生成低碳ODS鍵合相

［(Si-O-)3Si-C18H37］。

當前40頁，總共62頁。（3）表面覆蓋度覆蓋度的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導。

Partisil5-ODS的表面覆蓋度為98％，即殘存2％的硅醇基，分配占主導。

Partisil10-ODS的表面覆蓋度為50％，既有分配又有殘余硅醇基的吸附作用。含碳量大，則載樣量大，保留能力強當前41頁，總共62頁。（二）正相鍵合相色譜法

最常用的有氰基（-CN）氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）極性鍵合相。流動相一般用非極性或弱極性有機溶劑，如正己烷溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調節(jié)流動相的洗脫強度。通常用于分離能溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。4.鍵合相的特點①固定相不易流失，壽命長②選擇性好③穩(wěn)定性好④傳質快，柱效高⑤適于作梯度洗脫。當前42頁，總共62頁。分離選擇性：極性強的組分k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，tR

減小。分離機制分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質在兩相的溶解吸附：溶質與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用當前43頁，總共62頁。（二）反相鍵合相色譜法

典型的反相鍵合色譜法是用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）鍵合相；流動相常用甲醇-水或乙腈-水。

反相色譜的保留機制還沒有一致的看法，有分配與吸附之爭，還有疏溶劑理論等。鍵合基團的覆蓋率高，分配為主；覆蓋率低，吸附為主。如果覆蓋率高，對殘余硅醇基封尾，則吸附作用大為降低。當前44頁，總共62頁。

疏溶劑理論把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強的疏水特性。一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從極性流動相中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動的親合作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。當前45頁，總共62頁。保留行為的主要影響因素1、溶質的分子結構（極性）

極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；2、固定相硅膠表面鍵合烷基越大，覆蓋度越大，則溶質的k越大。3、流動相極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇、已腈為強溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大當前46頁，總共62頁。稠環(huán)芳烴的分析

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：30oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器當前47頁，總共62頁。反相鍵合相色譜法是應用最廣的色譜法，主要用于分離非極性至中等極性的各類分子型化合物.派生的離子抑制法、離子對法還可用于酸、堿、鹽的分析。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。（三）反相離子對色譜法

把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counterion）生成中性離子對，增加溶質與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。當前48頁，總共62頁。原理

樣品離子反離子

中性締合物（只溶于有機相）

有機堿

A固定相

+

?離子對試劑水相當前49頁，總共62頁。影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質的k增大；在一定范圍內試劑的濃度升高，溶質的k增大流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質（同一般RP-HPLC）。

離子對試劑的選擇分析酸類或帶負電荷物質：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等當前50頁，總共62頁。分析堿類或帶正電荷的物質：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、適用范圍：有機酸、堿、鹽等離子型和非離子型化合物的混合物。反相離子對色譜很易實現(xiàn)，用ODS柱，在流動相甲醇-水或乙腈-水中加入0.03～0.01mol/L的離子對試劑即可。反相離子對色譜法分析奶粉中三聚氰胺流動相：含10mM檸檬酸和10mM辛烷磺酸鈉的緩沖液(pH3.0):甲醇=7:3當前51頁，總共62頁。（四）離子抑制色譜法

用反相色譜法，通過調節(jié)流動相的pH值，抑制組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術稱為離子抑制色譜法。1．抑制劑通過向流動相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽）為抑制劑，調節(jié)pH值，抑制組分的解離，增加中性分子存在的幾率。如分離十二烷酸時，可在流動相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的離解當前52頁，總共62頁。2．容量因子及其影響因素除與反相色譜法有相同的影響因素外，主要受流動相的pH值的影響。對于弱酸，即流動相的pH值小于它的pka值時，主要以分子形式HB存在，k值增大，tR增大；反之，pH＞pka，組分以離子形式B為主，k值變小，tR減小，對于弱堿，情況相反。當前53頁，總共62頁。3．適用范圍

適用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸；6.0≤pKb≤7.0的弱堿。對于pKa＜3.0的酸及pKb<6.0的堿，應采用離子對色譜法或離子交換色譜法。在進行離子抑制色譜法時，流動相的pH需在2～8之間

流動相的pH值應調節(jié)至比組分的pK值大（對堿）或?。▽λ幔?~2個單位以上，使分子形式的的分布系數(shù)較大，有較大的k值。當前54頁，總共62頁。（四）分離類型的選擇當前55頁，總共62頁。第4節(jié)改善分離度的方法在高效液相色譜分析中，實際上固定相種類的選擇十分有限，當色譜柱選定后，主要通過調節(jié)流動相的組成改善分離.雖然n也受流動相的影響，但主要由色譜柱的性能所決定，溶劑系統(tǒng)主要影響容量因子k和分配系數(shù)比α。選擇不同種類的溶劑或改變多元溶劑系統(tǒng)的配比，都會改變k和α值，影響分離度。當前56頁，總共62頁。一、對流動相的要求①與固定相不互溶②純度高不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產生“偽峰”③粘度低若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離.

當前57頁，總共62頁。④與檢測器匹配⑤對樣品有適宜的溶解度⑥毒性小1.加入調節(jié)劑調節(jié)k二、改善分離度的方法使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物有較大差異。當前58頁，總共62頁。

通常希望組分的容量因子k保持在2~10范圍內，若組分的k