生物分離工程-第七章-色譜技術(shù)

生物工程下游技術(shù)第七章色譜技術(shù)目的和要求

了解色譜原理，掌握各種常用色譜方法的操作與應(yīng)用。

目錄色譜原理與分類色譜過程理論模型分離度凝膠過濾色譜離子交換色譜疏水性相互作用色譜流通色譜本章主要知識點什么是色譜分離技術(shù)？色譜分離技術(shù)的分類什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計算？吸附色譜及其分類和基本原理什么是分配色譜？離子交換色譜的分類及應(yīng)用凝膠色譜的分離原理及分類離子交換及疏水作用層析的原理高效液相色譜的分離原理及應(yīng)用蛋白質(zhì)分離的常用色譜方法有哪些？色譜技術(shù)（分配色譜）概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達到分離的目的。一、色譜原理與分類－學(xué)習(xí)要點識記：色譜方法分類理解：色譜原理

1、定義（chromatograph）定義

色譜是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不混溶的兩相間分配行為的差別而引起移動速度的不同而進行分離的方法。2、原理

色譜操作中互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相。固定相填充于柱內(nèi)形成固定床，在柱的入口端加入料液后，連續(xù)輸入流動相，料液中溶質(zhì)在流動相與固定相之間擴散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡在色譜過程中，分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的概率大，隨流動相移動速度小。由此，溶質(zhì)之間由于移動速度的不同而得到分離。3、色譜分離方法的分類色譜分離方法很多，種類有四、五十種，但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分以下幾種：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜色譜系統(tǒng)的基本組成（1）流動相分類氣相色譜液相色譜超臨界色譜（2）固相分類類型

分配色譜（固定相為液相）吸附色譜（固定相為固相）形狀

紙色譜薄層色譜柱色譜紙層析薄層層析（3）操作壓力分類低壓液相色譜（<0.5MPa）中壓液相色譜（0.5-4.0MPa）高壓液相色譜（>4.0MPa）（4）流動相流動方式分類軸向流色譜徑向流色譜（5）分離操作方式分類洗脫色譜迎頭色譜頂替展開（6）機理分類凝膠過濾色譜離子交換色譜反相色譜疏水性相互作用色譜親和色譜4、色譜分離原理分配系數(shù)可由Langmuir方程得出Kd分配系數(shù)q、c溶質(zhì)在固相和液相中的濃度保留時間（tR）和保留體積（VR）反應(yīng)樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一阻滯因子Rt阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和標(biāo)準物（與固定相沒有親和力的流動相Kd=0）的遷移率之比其意義在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小洗脫體積色譜柱中，使溶質(zhì)從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異塔板理論馬?。∕artin）和欣革（Synge）最早提出塔板理論，將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板（theoreticalplate），一個理論塔板的長度稱為理論塔板高度（theoreticalplateheight）H。經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。由于色譜柱內(nèi)的塔板數(shù)相當(dāng)多，因此即使組分分配系數(shù)只有微小差異，仍然可以獲得好的分離效果。色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計算方法：N理論塔板數(shù)tR保留時間W1/2半峰寬Wb峰底寬度理論塔板高度：L柱長5、分離度識記：分離度的概念理解：如何分離度判斷兩個相鄰洗脫峰的分離程度（1）定義及表述定義

分離度又稱分辨率，是表達兩種洗脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度

分離度的表達Gauss洗脫曲線的分離度

（2）分離度的其它表征方法容量因子

容量因子是固定相與流動相間溶質(zhì)分配量之比，用k’表示選擇性

選擇性為洗脫峰相鄰的兩種溶質(zhì)的容量因子之比6、凝膠過濾色譜－學(xué)習(xí)要點理解：凝膠過濾的原理和操作，凝膠過濾介質(zhì)的要求和影響分離特性的因素應(yīng)用：掌握凝膠色譜的應(yīng)用及特點（1）定義凝膠過濾色譜利用凝膠粒子為固定相，是根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子量的差別進行分離的液相色譜法（2）原理在GFC柱中，分子量大的溶質(zhì)不能進入凝膠介質(zhì)，而沿介質(zhì)空隙流過分子量很小的溶質(zhì)能夠進入所有的細孔中，其洗脫體積接近柱體積分子兩介于兩者之間的溶質(zhì)能夠進入部分細孔中（3）分配系數(shù)凝膠過濾色譜的分配系數(shù)可用下式表示GFC的分配系數(shù)在0～1之間，分離精度有限。Smallestsolute:(acetone)Fullaccesstothepores,Vt;Largestsolute:(BlueDx2000)Excludedfromthepores,V0

（4）影響分配系數(shù)因素相對分子量

相對分子量一定的溶質(zhì)的m值為常數(shù)，為凝膠介質(zhì)對該溶質(zhì)的有效孔隙率εp；

分配系數(shù)隨相對分子量的增加而降低；分子形狀凝膠結(jié)構(gòu)（5）介質(zhì)應(yīng)滿足條件親水性高，表面惰性穩(wěn)定性好，在較寬的pH和離子強度范圍及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力；（6）常用的GFC介質(zhì)葡聚糖凝膠介質(zhì)葡聚糖（右旋糖酐）與環(huán)氧氯丙烷合成瓊脂糖凝膠介質(zhì)瓊脂糖與環(huán)氧氯丙烷合成其他親水性高分子合成的凝膠介質(zhì)多種多糖制備的凝膠介質(zhì)SephadexGSepharoseCL/FFTSKSuperose（7）凝膠特性參數(shù)排阻極限不能擴散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對分子質(zhì)量分級范圍能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對分子量范圍溶脹率介質(zhì)溶脹后每千克干凝膠所吸收的水分的百分數(shù)其他參數(shù)凝膠粒徑、床體積、空隙體積（8）影響操作的因素線速度料液體積料液濃度分子量與分配系數(shù)關(guān)系凝膠粒徑（9）應(yīng)用分離純化脫鹽相對分子量測定（10）特點溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率接近100%；分離結(jié)束后無需苛刻的介質(zhì)清洗或再生，循環(huán)操作易實現(xiàn)，提高了產(chǎn)品純度；作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快、精度高；與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白活性收率高；分離機理簡單，操作參數(shù)小，規(guī)模放大容易；（11）不足僅根據(jù)溶質(zhì)間相對分子質(zhì)量的差異進行分離，選擇性低，料液處理量小，一般為柱體積的5%；經(jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋，因此需要在其它濃縮作用的單元操作后使用；7、離子交換色譜－學(xué)習(xí)要點理解：離子交換色譜的原理和操作，線性剃度洗脫過程和逐次洗脫過程應(yīng)用：掌握離子交換色譜的應(yīng)用特點（1）概念

離子交換色譜利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間的靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫色譜法（2）分配系數(shù)溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可表示為其中m∞為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)分配系數(shù)對I很敏感，I微小的變化都會引起分配系數(shù)的改變；不同蛋白質(zhì)B值相差很大主要陰離子交換配基二乙胺乙基，Diethylaminoethyl(DEAE)Quaternaryaminoethyl(QAE)季胺乙基，Quaternaryammonium(Q)主要陽離子交換配基羧甲基，Carboxymethyl(CM)磺丙基，Sulphopropyl(SP)Methylsulphonate(S)（3）線性洗脫法線形洗脫法（lineargradientelution)流動相的離子強度線性增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大特點難于洗脫的溶質(zhì)在較小流動相體積下洗脫；改變流動相離子強度增大速度可調(diào)節(jié)溶質(zhì)的洗脫體積；流動相離子強度（鹽濃度）連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣；需要特殊調(diào)配濃度梯度的設(shè)備（4）階躍梯度洗脫法階躍梯度洗脫法（Stepwiseelution）流動相的離子強度階躍增大，溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。特點當(dāng)階躍速度很快，則其接近線性梯度洗脫；反之，則接近恒定洗脫；利用切換不同鹽濃度的流動相進行洗脫，不需要特殊梯度設(shè)備，操作簡便；流動相濃度不連續(xù)變化，易出干擾峰；易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊現(xiàn)象；（5）洗脫時間線性梯度洗脫過程中溶質(zhì)的遷移速度vp為m(I)不再為常數(shù)，而是I的函數(shù)由于與生物大分子相比，IEC柱內(nèi)鹽離子在固定相粒子內(nèi)傳質(zhì)非常快，鹽離子在兩相間的平衡瞬間完成，則對鹽離子而言，可有如下的方程：對線性梯度而言洗脫時間通過測定不同流動相離子強度梯度下溶質(zhì)洗脫位置離子強度Ip值，可獲得Ip與GH之間的關(guān)系曲線其中洗脫時間為：（P275圖7-21）（6）IEC柱內(nèi)溶質(zhì)遷移在線性梯度洗脫條件下，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶的后部移動速度高于前部，即線性梯度洗脫具有區(qū)帶濃縮作用；由于軸向返混和傳質(zhì)阻力的影響，溶質(zhì)區(qū)帶在洗脫過程中不斷分散；洗脫操作前期，返混等占主導(dǎo)地位，區(qū)帶寬度不斷增加；隨著區(qū)帶寬度的增加，區(qū)帶前后溶質(zhì)運動速度差增大，即濃縮作用增大當(dāng)區(qū)帶寬度增至一定值后，濃縮與分散作用達到平衡，區(qū)帶將以一定的寬度向下移動（7）分離度當(dāng)離子強度梯度一定時，分離度與柱高無關(guān)當(dāng)柱高一定時，分離度隨離子強度梯度的降低而增大分離度與成反比（8）特點料液處理量大，具有濃縮作用；應(yīng)用范圍廣泛，通過優(yōu)化條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長短；吸附作用機理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收率高；離子交換劑種類多，選擇余地大，價格遠低于親和吸附劑；影響分離特性因素復(fù)雜；8、疏水性相互作用色譜學(xué)習(xí)要點理解：原理，影響疏水性吸附的因素應(yīng)用：掌握疏水性相互作用色譜方法對蛋白質(zhì)分離（1）定義

疏水性相互作用色譜利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團（疏水性配基）的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫色譜法。（2）原理組成蛋白質(zhì)的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基團，如苯丙氨酸，酪氨酸；這些基團大部分處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，但有部分疏水基團暴露于蛋白質(zhì)表面；在高離子強度鹽溶液中，蛋白質(zhì)表面的水化層被破壞，更多的疏水部分暴露在外這些暴露在外的疏水基團與介質(zhì)上的弱疏水性配基發(fā)生疏水性作用，被固定相吸附蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動相鹽析鹽濃度的提高而增大HIC采用高鹽下吸附，低鹽下洗脫原理圖示（3）疏水性吸附劑常用配基

苯基、短鏈烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修飾密度

疏水配基修飾密度一般在10~40umol/ml疏水性吸附作用與配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異。（4）影響疏水性吸附的因素

－離子強度、種類和破壞水化作用的物質(zhì)離子強度及種類

蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強度提高而增大；離子的種類也對蛋白質(zhì)疏水性吸附有著重要影響破壞水化作用的物質(zhì)

離子半徑大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子間相互作用，具有破壞水化作用的性質(zhì)（離液離子）

離液離子存在下疏水性作用減弱；乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作為洗脫促進劑；影響疏水性吸附的因素

－離液離子及順序影響疏水性吸附的因素

－表面活性劑及溫度表面活性劑

表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。溫度

一般吸附為放熱過程，而疏水性吸附的結(jié)合作用隨溫度升高而增大（5）特點在高鹽濃度下疏水作用較大，HIC可直接分離鹽析后蛋白質(zhì)溶液可通過調(diào)節(jié)疏水性配基鏈長和密度調(diào)節(jié)HIC的吸附力吸附劑種類多，選擇余地大9、反相色譜學(xué)習(xí)要點理解：反相色譜技術(shù)的原理及操作，應(yīng)用：了解反相色譜技術(shù)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點（1）定義定義

利用表面非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差別進行分離純化的洗脫層析法與HIC的異同反相層析中溶質(zhì)亦通過疏水性作用分配于固定相表面；反相層析固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性；必須采用極性有機溶劑或其水溶液進行洗脫（2）分配系數(shù)溶質(zhì)在反相色譜中分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，疏水性越大，分配系數(shù)越大；當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)；流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大，因此反相層析多采用降低流動相極性的線性梯度洗脫法（3）常用介質(zhì)載體

硅膠、高分子聚合物微球配基

丁烷基(C4)、辛烷基(C8)、十八烷基(C18)或苯基修飾方法（4）特點反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高；應(yīng)用廣泛，可用于分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、多糖、植物堿等，應(yīng)用于科學(xué)研究、臨床診斷、工業(yè)檢測和環(huán)境保護等各個行業(yè)；作為產(chǎn)品純化制備手段，多限于實驗室規(guī)模的應(yīng)用。10、流通色譜學(xué)習(xí)要點理解：流通色譜技術(shù)的原理及操作應(yīng)用：了解流通色譜技術(shù)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點（1）定義定義流通色譜指利用含有對流孔的介質(zhì)為固定相的液相色譜法流通色譜作為一種分離模式，可包括各種吸附色譜，如IEC、HIC、AC和RPC傳統(tǒng)色譜的缺陷傳統(tǒng)的吸附色譜介質(zhì)孔徑較小，一般在100nm以下，流體阻力大；通常的色譜操作壓力下流體無法進入固定相介質(zhì)的孔內(nèi)，孔內(nèi)傳質(zhì)為擴散傳質(zhì)；柱效隨流速增大而迅速下降，動態(tài)吸附容量亦如此；（2）介質(zhì)結(jié)構(gòu)穿透孔

孔徑在0.6~0.8um,孔內(nèi)流動為對流形式；擴散孔孔徑在50~100nm,孔內(nèi)傳質(zhì)為擴散傳質(zhì)；（3）介質(zhì)結(jié)構(gòu)的特點流通色譜介質(zhì)穿透孔之間以擴散孔相連，保證了介質(zhì)大的比表面積和溶質(zhì)吸附量擴散孔長度大大縮短，降低了擴散傳質(zhì)阻力；色譜操作線速度大于500cm/h柱效色譜柱效的普遍化公式為在u很大時，其中因此（4）介質(zhì)制備POROS流通色譜介質(zhì)該制備方法是首先合成微球，然后通過聚集形成聚集體，最終經(jīng)聚集體的再聚合形成所需粒徑的分離介質(zhì)聯(lián)合致孔法

通過固、液聯(lián)合致孔方法合成雙分散孔型層析介質(zhì)，該方法適用范圍廣，合成方法簡單；連續(xù)床色譜介質(zhì)以色譜柱為模具，在柱內(nèi)原位合成多孔型聚合物單塊，再經(jīng)適當(dāng)?shù)墓δ芑捎糜诜蛛xPOROS流通色譜介質(zhì)流通色譜

－介質(zhì)制備（2）B.雙孔微球（BiPB）

A.微孔微球（MiPB）（孔徑10-100nm）熒光標(biāo)記瓊脂糖吸附劑的激光掃描共聚焦顯微鏡HETPvs.流速雙峰孔徑分布，為10～100nm和500～3000nm

高流速（40cm/min）下BiPB的動態(tài)容量和柱效約為MiPB的3倍瓊脂糖大孔介質(zhì)孔擴散系數(shù)提高1倍，靜態(tài)容量提高40％，動態(tài)容量提高50％在5～18cm/min的范圍內(nèi)柱效與流速無關(guān)，適合高速色譜分離蛋白質(zhì)。（5）連續(xù)床優(yōu)點連續(xù)床在柱內(nèi)原位合成制備，避免了傳統(tǒng)的顆粒填充床顆粒制備和層析柱的填充過程；連續(xù)床介質(zhì)在層析柱內(nèi)為多孔型連續(xù)相，孔徑在亞微米及微米級之間，在中、低壓力下液體可高速通過連續(xù)床孔隙，兩相間發(fā)生對流傳質(zhì)；連續(xù)床介質(zhì)為連續(xù)相，內(nèi)部孔隙率可達0.8以上，提高了層析柱的有效利用空間。11、置換色譜學(xué)習(xí)要點理解：置換色譜技術(shù)的原理及操作，應(yīng)用：了解置換色譜技術(shù)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點（1）置換色譜原理置換色譜基于置換劑與吸附質(zhì)間在吸附劑表面的競爭性吸附；載液平衡的層析柱添加一定量料液，料液中溶質(zhì)吸附于入口處。連續(xù)輸入含有置換劑的溶液，置換劑與固定相表面結(jié)合位點的親和力比料液中的各組分都要高，其與料液中各組分競爭固定相的結(jié)合位點，將吸附的溶質(zhì)置換下來；同樣，吸附作用強的溶質(zhì)也會競爭吸附作用弱溶質(zhì)所占據(jù)的位點，推動其向出口移動；－置換色譜原理（2）在優(yōu)惠吸附系統(tǒng)中，如果色譜柱足夠長，各組分按其與固定相親和力的大小順序形成彼此相連的純組分區(qū)帶；由于置換劑的移動速度一定，故各組分區(qū)帶的移動速度也為定值，形成“等速置換列”；如果一種組分由于某種原因進入到……置換色譜原理示意（2）置換色譜特點與一般的洗脫色譜經(jīng)常出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象相比，置換列中各溶質(zhì)區(qū)帶的邊界陡直，因此置換層析的分辯率高；置換色譜具有濃縮作用，并可通過調(diào)節(jié)置換劑濃度控制分離產(chǎn)品的濃度，處理量大，并特別適用于處理稀料液；置換列中各組分區(qū)帶緊密相連，層析柱利用率高，流動相用量少；與親和色譜專一性純化單一目標(biāo)產(chǎn)物相比，置換層析同時實現(xiàn)多個目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化，適于含有多個目標(biāo)產(chǎn)物料液的分離；與梯度洗脫色譜相比，置換色譜過程中料液、置換劑和再生劑均以簡單階躍函數(shù)的形式輸入，容易進行連續(xù)色譜分離；12、吸附色譜原理:利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實現(xiàn)分離關(guān)鍵要素：吸附劑和展開劑的選擇吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團，如-OH和-NH2Adsorptionchromatography常用的吸附劑：氧化鋁硅膠活性炭纖維素聚酰胺硅藻土展開劑的選擇展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大因此，可以根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果展開劑選擇的原則：（1）對被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略?。?）展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力一般吸附色譜的操作程序根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動相吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)洗脫：采用有機溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強度，最大限度地回收目標(biāo)產(chǎn)物12、分配色譜原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法要素：固定相、載體、流動相載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體載體種類：硅膠硅藻土纖維素葡聚糖凝膠固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相詳見P247流動相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）*反相色譜固定相是非極性的,流動相是極性的HPLCHPLCChromatogram反相液相色譜反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)使基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學(xué)性質(zhì)和流動相的選擇應(yīng)最大限度地滿足疏水的要求通常在流動相中加入離子對試劑（三氟乙酸）來增大蛋白質(zhì)和多肽的疏水性載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm）

HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)

C18適于分離核酸苯基流動相的選擇通常采用有機溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃SourceRPC30μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法常用的離子交換樹脂葡聚糖凝膠型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑

DEAE-SephacelCellex系列瓊脂糖系列離子交換劑

Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑Source系列離子交換劑特點：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低陽離子交換樹脂S系列陰離子交換樹脂Q系列MonoBeads系列離子交換劑（Pharmacia）特點：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點，但動態(tài)載量更大，壽命更長。同樣分為Q系列和P系列MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2ExpandedBed分子篩凝膠色譜在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離優(yōu)點： 操作簡便 分離效果好，重復(fù)性高，回收率高 分離條件溫和 應(yīng)用廣泛適用于生物大分子的初級分離，脫鹽 分辨率低分子篩凝膠色譜原理Desaltingproteinsproteinssalts疏水作用層析

(HydrophobicInteractionChromatography）HydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicityMechanismofHICA2800.04AUNa2SO41.0M疏水層析操作凝膠色譜填料葡聚糖凝膠SephadexG-系列聚丙烯酰胺凝膠

Sephacryl系列瓊脂糖凝膠Sepharose系列Superose系列親和色譜（Affinitychromatography）載體活化、配基連接、吸附、洗脫Competitiveelution蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法免疫親和層析 屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離免疫親和層析介質(zhì)的獲得：（1）獲得抗體（2）抗體連接到載體上疏水層析 在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。操作要點 蛋白質(zhì)的局部變性 洗脫采用逐步降低鹽濃度的方法進行離子交換色譜是最常用的蛋白質(zhì)分離手段操作要點：由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定由于蛋白質(zhì)的極性基團很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑適當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當(dāng)解離，通常采用的pH值靠近其等電點（不是等電點）緩沖溶液的離子強度不能過高，通常在10~20mmol層析方案的確定，需要視試驗情況作適當(dāng)調(diào)整洗脫方式：pH梯度離子強度梯度AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex200p.g.GFPurification

factorQSepharoseFF10timespurification82%yieldPhenylSepharoseHPHICY.-F.Liaoetal.(1996)J.Biol.Chem.271,283486