兒童遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤軟骨帽的超微結(jié)構(gòu)觀察

兒童遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤軟骨帽的超微結(jié)構(gòu)觀察郭永成;王永堂;陸亞東;夏冰;牛學強;董延召;武慧玲;馬潤生【摘要】目的觀察兒童遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤(hereditarymultipleexostoses,HME)軟骨帽的超微結(jié)構(gòu),為兒童HME超微病理診斷提供可靠依據(jù)?方法實驗組:切除18例HME患兒肋骨瘤體分離軟骨帽;對照組:15例胸廓發(fā)育畸形患兒手術矯正切除的肋軟骨;分別取其縱、橫切面應用掃描電鏡和透射電鏡觀察.結(jié)果對照組:冷凍斷裂的軟骨組織內(nèi)見少量軟骨細胞位于軟骨陷窩內(nèi),軟骨組織表面可見大量散亂、稀疏的膠原纖維;軟骨細胞數(shù)量不多,細胞表面有少量短小的微絨毛,細胞核形狀不規(guī)則,細胞質(zhì)內(nèi)可見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈條索樣分散在細胞質(zhì)內(nèi),線粒體較小,糖原顆粒呈簇狀分布?實驗組:冷凍斷裂的軟骨組織內(nèi)見大量不規(guī)則的軟骨陷窩，每個軟骨陷窩內(nèi)均含有軟骨細胞,細胞表面有豐富的細胞突起;軟骨組織內(nèi)見大量瘤樣細胞增生,聚集分布,細胞核較大,細胞質(zhì)內(nèi)可見圓形或橢圓形的線粒體及擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);瘤細胞間可見毛細血管,其附近可見明顯增多的軟骨細胞,軟骨細胞體積較對照組增大?結(jié)論兒童HME軟骨帽的超微結(jié)構(gòu)改變(細胞形態(tài)及細胞內(nèi)部細胞器)，不同于正常軟骨細胞，可能與兒童HME的遺傳、發(fā)病、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸因素密切相關.％PurposeToimprovethegeneralunderstandingoftheultrastructuralpathologyofchildrenhereditarymultipleexostoses(HME),throughtheultrastructuralobservationofthecartilagecap,andtoexplorethepathogenesisofthediseasetoprovideareliablebasisforthediagnosisofchildrenHME.MethodsEighteencasesofchildrenHMEribstumor(experimentalgroup)wereresectedwithseparatingcartilagecap.15casesofchildrenthoracicsurgicalcorrectionwereusedascontrolwhohascostalcartilagedevelopmentalmalformations.Electronmicroscopywasusedtoobservetheultrastructuralchangesonthelongitudinalsectionandcrosssectionofthetissues,respectively.ResultsInthecontrolgroup,thefreeze-fractureofthecartilagetissueshowedasmallamountofcartilagecelllocatedincartilagelacunae;alargenumberofscattered,sparsecollagenfiberswereobservedonthesurfaceofthecartilagetissue;inasmallnumberofchondrocytes,shortmicrovillionthecellsurface,irregularnucleus,androughcord-likeendoplasmicreticulum,smallmitochondriaandglycogenparticleswereseenwithinthecytoplasm.Intheexperimentalgroup,alargenumberofirregularcartilagelacunaewereseeninthefreeze-fractureofthecartilagetissueandeachcartilagelacunaecontainedchondrocytes.Itwasalsoobservedthatthecellsurfacewascoveredwithplentyofcellprotrusions.Andalargenumberoftumorlikecellhyperplasiawerefoundinthecartilagetissue,whichhadclustereddistributionwithlargenuclei.Roundoroval-shapedmitochondriaandexpansionofroughendoplasmicreticulumcouldbeseeninthecytoplasm.Capillarieswereobservedbetweenthetumorcellsandcartilagecells,withsignificantlyincreasedaroundthetumor-likecells.Comparedwiththecontrolgroupthevolumeofthecartilagecellappearedconsiderablelarge.ConclusionsTheultrastructuralchangesofthechildrenHMEcartilagecap(cellmorphologyandcellinternalorganelles)aredifferentfromnormalcartilagecells.Thiscouldbecloselyrelatedtothehereditarytrait,pathogenesis,developmentandoutcomeofchildrenHME.期刊名稱】《臨床與實驗病理學雜志》年(卷),期】2013(029)002【總頁數(shù)】4頁(P171-174)【關鍵詞】骨腫瘤;遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤;軟骨帽;超微結(jié)構(gòu);兒童【作者】郭永成;王永堂;陸亞東;夏冰;牛學強;董延召;武慧玲;馬潤生【作者單位】鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052;鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科,鄭州,450052【正文語種】中文【中圖分類】R726遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤(hereditarymultipleexostoses,HME)是一種累及軟骨化骨的常染色體顯性遺傳病，又稱多發(fā)性外生骨疣，屬于良性骨腫瘤［1］。其特點是生長于瘤體頂部有一形似帽子的軟骨層即軟骨帽，通過其深層的軟骨化骨作用，使瘤體持續(xù)生長［2］，腫瘤增大時可有局部疼痛和骨骼畸形，近關節(jié)的可引起活動障礙，或可壓迫鄰近的神經(jīng)而引起相應的癥狀，若腫瘤突然長大或生長迅速，應考慮惡變可能。很多學者從遺傳致病基因定位、發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)及分型、影像學等方面對HME進行深入的研究，軟骨帽過度生長已被認為是HME惡變的主要原因之一。本文現(xiàn)對18例HME的軟骨帽的超微結(jié)構(gòu)改變進行研究，探尋該病的發(fā)病機制，提高病理工作者對其認識水平。材料與方法1.1臨床資料選取鄭州大學第三附屬醫(yī)院小兒骨科2009年10月~2012年3月收治的18例HME患兒作為實驗組，男13例，女5例。納入標準:年齡6~12歲;有明確的家族遺傳病史;身上有A3處明顯增大的骨軟骨瘤;腫瘤持續(xù)增長，需切除胸廓肋骨處骨軟骨瘤;術前經(jīng)影像學（X線、CT、MRI）明確診斷;術后常規(guī)病理學確診為骨軟骨瘤。同時選擇我院小兒骨科同期收治的因胸廓肋骨發(fā)育畸形的患兒，因手術矯正切除的肋軟骨15例作為對照組。納入標準:與實驗組在患兒年齡、性別標本處理方法等相配對;明確無家族遺傳病史;術前檢查無代謝系統(tǒng)及它處骨骼疾病。以上病例均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批和家屬簽署知情同意書。1．2方法1.2.1掃描電鏡所取HME軟骨帽及軟骨標本用緩沖液清洗表面后，立即置于2.5%的戊二醛固定液中4工固定2h以上（固定液內(nèi)含有0.1mol/LPBS、4%多聚甲醛）,0.1mol/LPBS浸洗30min，液氮內(nèi)斷裂，1%四氧化鋨固定液4工后固定2h以上（固定液內(nèi)含有0.1mol/LPBS）,0.1mol/LPBS浸洗10min，乙醇梯度脫水:30%乙醇10min;50%乙醇10min;70%乙醇10min;90%乙醇10minx2;100%乙醇10minx3;醋酸戊酯置換10min,臨界點干燥后，噴金（離子濺射鉑金），掃描電鏡下觀察軟骨組織的斷裂面、拍照。掃描式電子顯微鏡:日本日立公司TM-1000。1.2.2透射電鏡所取HME軟骨帽及軟骨標本立即置于2.5%的戊二醛固定液中4工固定2h以上（固定液內(nèi)含有0.1mol/LPBS、4%多聚甲醛）,0.1mol/LPBS浸洗30min,1%四氧化鋨固定液4工后固定2h（固定液內(nèi)含有0.1mol/LPBS）,0.1mol/LPBS浸洗10min，乙醇梯度脫水:30%乙醇10min、50%乙醇10min、70%乙醇10min;70%乙醇醋酸雙氧鈾塊染2h或過夜;90%乙醇10minx2;100%乙醇10minx3;還氧丙烷置換10min;環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1~2pl,美藍染色后光學顯微鏡下定位，瑞典LKB-V型超薄切片機進行超薄切片50-70nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。透射式電子顯微鏡:日本日立公司H-7650。結(jié)果2．1掃瞄電鏡觀察對照組:冷凍斷裂的軟骨組織內(nèi)見少量的軟骨細胞位于軟骨陷窩內(nèi)，細胞呈圓形或不規(guī)則，細胞表面有少量的突起（圖1）;軟骨組織表面可見大量散亂、稀疏的膠原纖維（圖2）。實驗組:冷凍斷裂的軟骨組織內(nèi)見大量不規(guī)則的軟骨陷窩，每個軟骨陷窩內(nèi)均含有軟骨細胞，細胞增生明顯，軟骨細胞體積較大，形狀不規(guī)則，細胞表面有豐富的細胞突起（圖3）;軟骨組織表面的膠原纖維較對照組結(jié)構(gòu)致密（圖4）。圖1對照組:組織內(nèi)見少量的軟骨細胞位于軟骨陷窩內(nèi)，細胞呈圓形或不規(guī)則，細胞表面有少量的突起圖2對照組:軟骨組織表面可見大量散亂、稀疏的膠原纖維圖3實驗組:組織內(nèi)見大量不規(guī)則的軟骨陷窩，每個軟骨陷窩內(nèi)都含有軟骨細胞，細胞增生明顯，軟骨細胞體積較大，形狀不規(guī)則，細胞表面有豐富的細胞突起圖4實驗組:軟骨組織表面的膠原纖維較對照組結(jié)構(gòu)致密2．2透射電鏡觀察對照組:軟骨細胞數(shù)量不多，細胞多呈橢圓形，細胞表面有少量短小的微絨毛，細胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)凝集、邊集（圖5）;細胞質(zhì)內(nèi)可見到少量的細胞器，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈條索樣分散在細胞質(zhì)內(nèi)，線粒體較小，糖原顆粒呈簇狀分布（圖6）。實驗組:大量的瘤樣細胞增生，瘤細胞體積較大，聚集分布;細胞核較大，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核仁明顯，核質(zhì)比較高;細胞質(zhì)內(nèi)可見圓形或橢圓形的線粒體及擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，溶酶體數(shù)量不多;瘤細胞間可見毛細血管，血管腔內(nèi)充滿紅細胞及血漿蛋白，細胞間亦有蛋白樣物質(zhì)的沉積（圖7）;在瘤樣細胞附近可見明顯增多的軟骨細胞，軟骨細胞體積較對照組增大，形態(tài)呈梭形，細胞核圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，有明顯的核仁;細胞質(zhì)內(nèi)可見到大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈池樣擴張，擴張的池內(nèi)充滿細顆粒樣物質(zhì):線粒體數(shù)量較少，游離核糖體?？梢姷?圖8)。圖5對照組:細胞多呈橢圓形，細胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)凝集、邊集圖6對照組:細胞質(zhì)內(nèi)可見到少量的細胞器，線粒體較小，糖原顆粒呈簇狀分布圖7實驗組:瘤樣細胞增生，細胞核較大，核仁明顯，瘤細胞間可見到毛細血管，血管腔內(nèi)充滿紅細胞及血漿蛋白圖8實驗組:細胞核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，細胞質(zhì)內(nèi)可見到大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈池樣擴張，池內(nèi)有蛋白樣物質(zhì)的沉積討論3?1病變特點遺傳學表明HME是一種累及骨骼系統(tǒng)致使骨骺生長發(fā)育異常的常染色體顯性遺傳?。?］，以軟骨化骨形成障礙，形成骨軟骨瘤特征為主，多合并骨骼發(fā)育畸形，瘤體大部分發(fā)生于干骺端［4，5］，隨患者生長瘤體逐漸增大可影響機體形態(tài)及功能。本病男性多于女性，常見于兒童~青壯年，隨患者骨骼發(fā)育而生長，骨骺閉合后不再生長，若繼續(xù)生長有惡變可能，可惡變?yōu)檐浌侨饬?，其發(fā)病率為0.5%~2%。術前依據(jù)患兒的遺傳病史、陽性體征、影像學檢查等綜合評估病變性質(zhì)，對于影響機體功能、瘤體較大、局部疼痛的應早期手術切除［6］，防止兒童HME惡變?yōu)檐浌侨饬觯?］。3?2發(fā)病原因HME發(fā)病原因尚不完全清楚，一般認為致病因素有以下幾種。⑴胚胎生長發(fā)育異常;(2)骨骺板錯置移位;(3)骨膜內(nèi)層殘留的幼稚細胞發(fā)育轉(zhuǎn)化為軟骨細胞而成;(4)干骺端骨膜發(fā)育不完全，不能完全約束骨骺軟骨細胞，致使骨骼組織畸形生長形成骨軟骨瘤;(5)干骺端生長過程中重塑性差，從而使骨骺端連續(xù)增長形成瘤體［8］。分子遺傳學研究發(fā)現(xiàn)很多基因在HME的發(fā)病過程中起作用，其中以抑癌基因EXT突變最為重要［9］。EXT抑癌基因家族包括EXT1、EXT2、EXT3，三者在突變中所占的比例不同，EXT大多數(shù)基因突變?yōu)闊o義突變和框移突變［10］，而這些突變導致了蛋白質(zhì)翻譯的提前終止［11］，從而使EXT蛋白質(zhì)功能缺陷［12］。研究表明蛋白多糖側(cè)鏈（HS鏈）及Perlecan的表達紊亂致使EXT1和EXT2基因編碼的聚合酶改變是HME基因突變的主要原因。近年也有學者研究表明HME與酸性黏多糖的代謝混亂有關，HME患兒尿液中酸性黏多糖量明顯多于正常兒童，且隨患兒年齡增大骨軟骨瘤逐漸成熟，酸性黏多糖的排泄量也隨之減少［13］。3?3HME軟骨帽超微結(jié)構(gòu)改變研究表明HME瘤體的增長主要是軟骨帽細胞分裂增殖分化而成，且軟骨帽細胞是依靠單突變細胞克隆增殖［14］,因此對HME軟骨帽細胞的超微結(jié)構(gòu)進行研究分析十分重要。對HME軟骨帽細胞行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn):軟骨組織內(nèi)見大量不規(guī)則的軟骨陷窩，軟骨陷窩內(nèi)均含有軟骨細胞且細胞表面有豐富的突起，軟骨組織表面的膠原組織結(jié)構(gòu)致密。有學者通過Westernblot法研究HME,顯示軟骨帽細胞表面豐富的突起與actin束有關［15］,這些突起與actin束相連導致腫瘤細胞體積的增大，還可促使細胞形態(tài)的改變。軟骨細胞包埋于軟骨基質(zhì)內(nèi),軟骨基質(zhì)的有機成分為多糖物質(zhì)和蛋白質(zhì)合成的軟骨黏蛋白,基質(zhì)中的膠原纖維約占基質(zhì)干重的40%，由10-20nm的膠原纖維交織而成，而膠原纖維的鈣化提示軟骨細胞的增生代謝旺盛，此HME軟骨帽組織內(nèi)膠原纖維致密,有鈣化傾向,表明瘤體細胞合成膠原纖維較多,有活躍的蛋白質(zhì)合成活動,具有一定的惡變傾向。本次行透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):HME軟骨帽有大量瘤細胞增生，瘤細胞體積較大,細胞核較大,常染色質(zhì)豐富,有明顯的核仁,可能與細胞蛋白質(zhì)合成旺盛,細胞增生活躍有關,合成一些正常軟骨細胞沒有合成或合成較少的蛋白質(zhì);軟骨帽瘤細胞體積的增大及細胞數(shù)量的增殖是軟骨帽厚度改變的主要原因［16］,而HME軟骨帽的厚度一般v1cm,若軟骨帽厚度A1cm或瘤體短期內(nèi)增大明顯及出現(xiàn)不規(guī)則鈣化者,則惡變的風險增加,應提高警惕盡早手術切除。HME軟骨帽細胞質(zhì)內(nèi)可見到大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈池樣擴張，擴張的池內(nèi)充滿細顆粒樣物質(zhì):線粒體數(shù)量較少，?？梢姷接坞x核糖體，溶酶體數(shù)量不多。而正常軟骨細胞不活躍，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體均不發(fā)達，此HME軟骨帽細胞可能與軟骨細胞分泌物量異常增加，超過其正常運輸能力，致分泌物滯留于腔內(nèi)[17]。因分泌物滯留、濃集所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)容物有一定的電子密度[15]。線粒體是細胞生物氧化產(chǎn)生能量的重要場所，被稱為細胞的“動力站”，瘤細胞內(nèi)線粒體的多少與細胞分化程度及腫瘤的組織學類型有關，HME軟骨帽瘤細胞內(nèi)的線粒體數(shù)量較正常軟骨細胞少，這可能是瘤體細胞的分化及所需能量部分來源于無氧酵解產(chǎn)生ATP有關[17]。HME軟骨帽瘤細胞間可見到毛細血管，血管腔內(nèi)充滿紅細胞及血漿蛋白，細胞間亦有蛋白樣物質(zhì)沉積。而正常軟骨細胞本身無血管和神經(jīng)，其營養(yǎng)由軟骨膜內(nèi)的毛細血管供應，目前尚不清楚瘤體細胞之間出現(xiàn)的毛細血管的原因，可能與瘤體細胞生長活躍，代謝增加有關[18]，也表明HME軟骨帽瘤細胞特性明顯。HME的病因?qū)W及發(fā)病機制研究雖然已經(jīng)取得了很大進展，但很多關鍵問題仍未解決。HME軟骨帽細胞超微結(jié)構(gòu)的研究為該病從細胞水平提示了可能的發(fā)病機制，同時為進一步闡明該病的發(fā)病原因提供有力證據(jù)。此研究也為今后更加深入研究HME的病因?qū)W奠定了一定的超微病理學基礎。參考文獻:李玉嬋，王志剛，王劍，郁婷婷．遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤基因型和臨床表型相關性分析[J].中華小兒外科雜志，2011,32(10):769-73.TahasildarN，SudeshP，GoniV，TripathySK．Giantosteochondromaofaxisinachildwithmultiplehereditaryexostoses:casereportandreviewofliterature[J]．JPediatrOrthopB，2012，21(3):280-5．RuizLP，LaraJC．Craniomaxillofacialfeaturesinhereditarymultipleexostosis[J]．CraniofacSurg，2012，23(4):336－8．AndreaCE，PrinsFA，WiwegerMI，HogendoornPCW．Growthplateregulationandosteochondromaformation:insightsfromtracingproteoglycansinzebrafishmodelsandhumancartilage[J]．JPathol，2011，224(2):160－8．高靄峰，田保玲，王勁歐，等．奇異性骨旁骨軟骨瘤性增生的臨床病理分析[J].臨床與實驗病理學雜志，2011,27(11):1251-2.施琳，蔣智銘，張惠箴，周雋．甲下外生性骨疣的臨床病理特征[J].臨床與實驗病理學雜志，2008,24(3):323-6.OhkumaR，McCarthyEF，DeuneEG．Hereditarymultipleexostosesinthehandsandfingers:earlypresentationandearlysurgicaltreatmentinfamilymembers.Casereports[J].Hand，2011，6(2):209-16.JonesKB.Glycobiologyandthegrowthplate:currentconceptsinmultiplehereditaryexostoses[J].JPediatrOrthop，2011，31(5):577-86.[9]DelgadoMA,Sarri6nP,AzarN,etal.AnovelnonsensemutationoftheEXT1geneinanArgentinianpatientwithmultiplehereditaryexostoses:acasereport[J].JBoneJointSurgAm,2012,94(11):76.姚豐,王應太,廖世秀,等.一個遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤家系的基因突變檢測[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志，2010,27(1):92-5..DeAndreaCE,ReijndersCMA,KroonHM,etal.SecondaryperipheralchondrosarcomaevolvingfromosteochondromaasaresultofoutgrowthofcellswithfunctionalEXT[J]．Oncogene，2012，31(9):1095－104．BoveeJV，Cleton-JansenAM，WuytsW，etal．EXT-mutationanalysisandlossofheterozygosityi