紫外熒光課件

紫外及熒光光譜法（UltravioletAbsorptionSpectroscopy）2023/4/3太陽(yáng)極紫外輻射2023/4/3紫外吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系紫外—可見(jiàn)吸收光譜概述紫外分光光度計(jì)紫外吸收光譜的應(yīng)用2023/4/3

表3.1

物質(zhì)顏色和吸收光的關(guān)系物質(zhì)顏色吸收光顏色波長(zhǎng)/nm黃綠紫400~450黃藍(lán)450~480橙綠藍(lán)480~490紅藍(lán)綠490~500紅紫綠500~560紫黃綠560~580藍(lán)黃580~610綠藍(lán)橙610~650藍(lán)綠紅650~7802023/4/3

在紫外和可見(jiàn)光區(qū)范圍內(nèi)，有機(jī)化合物的吸收帶主要由б-б*、π-π*、n-б*、n-π*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生。無(wú)機(jī)化合物的吸收帶主要由電荷遷移和配位場(chǎng)躍遷產(chǎn)生。各種躍遷情況如圖所示：第二節(jié)紫外—可見(jiàn)吸收光譜圖3.1電子躍遷圖2023/4/3

其中б-б*

躍遷所需能量最大，n-π*及配位場(chǎng)躍遷所需能量最小，因此，它們的吸收帶分別落在遠(yuǎn)紫外和可見(jiàn)光區(qū)。從圖中縱坐標(biāo)可知π-π*及電荷遷移躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度最大，π-π*、n-б*躍遷產(chǎn)生的譜帶強(qiáng)度次之，配位躍遷的譜帶強(qiáng)度最小。一、有機(jī)化合物的紫外—可見(jiàn)吸收光譜

（一）電子躍遷類(lèi)型

l、б-б*

躍遷它需要的能量較高，一般發(fā)生在真空紫外光區(qū)。飽和烴中的—C—C—鍵屬于這類(lèi)躍遷，例如乙烷的最大吸收波長(zhǎng)λmax為135nm。2023/4/32、n-б*躍遷實(shí)現(xiàn)這類(lèi)躍遷所需要的能量較高，其吸收光譜落于遠(yuǎn)紫外光區(qū)和近紫外光區(qū)，如CH3OH或CH3NH2的n-б*分別為183nm和213nm。3、π-π*躍遷它需要的能量低于б-б*的躍遷，吸收峰一般處于近紫外光區(qū)，在200nm左右。其特征是摩爾吸光系數(shù)大，一般εmax>104

為強(qiáng)吸收帶。如乙烯(蒸氣)的最大吸收波長(zhǎng)λmax

為162nm。4、n-π*躍遷這類(lèi)躍遷發(fā)生在近紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)，它是簡(jiǎn)單的生色團(tuán)如羰基、硝基等中的孤對(duì)電子向反鍵軌道的躍遷，其特點(diǎn)是譜帶強(qiáng)度弱，摩爾吸光系數(shù)小，通常小于100，屬于禁阻躍遷。2023/4/35、電荷遷移躍遷所謂電荷遷移躍遷是指用電磁輻射照射化合物時(shí)，電子從給予體向與接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷，因此，電荷遷移躍遷實(shí)質(zhì)是一個(gè)內(nèi)氧化——還原過(guò)程，而相應(yīng)的吸收光譜稱(chēng)為電荷遷移吸收光譜。2023/4/3（二）常用術(shù)語(yǔ)生色團(tuán)實(shí)例溶劑max/nmmax躍遷類(lèi)型烯C6H13CH=CH2正庚烷17713000→*炔C5H11C≡CCH3正庚烷17810000→*羰基CH3COCH3異辛烷27913n→*CH3COH異辛烷29017n→*羧基CH3COOH乙醇20441n→*酰胺CH3CONH2水21460n→*偶氮基CH3N=NCH3乙醇3395n→*硝基CH3NO2異辛烷28022n→*亞硝基C4H9NO乙醚300100n→*硝酸酯C2H5ONO2二氧六環(huán)27012n→*1、生色團(tuán)從廣義來(lái)說(shuō)，所謂生色團(tuán)，是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團(tuán)。表3.2一些常見(jiàn)生色團(tuán)的吸收特性2023/4/3

某些有機(jī)化合物經(jīng)取代反應(yīng)引入含有未共享電子對(duì)的基團(tuán)（-OH、-OR、-NH2、-SH、-Cl、-Br、-SR、-NR2

）之后，吸收峰的波長(zhǎng)將向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，這種效應(yīng)稱(chēng)為紅移效應(yīng)。這種會(huì)使某化合物的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)的基團(tuán)稱(chēng)為向紅基團(tuán)。

在某些生色團(tuán)如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后，吸收峰的波長(zhǎng)會(huì)向短波方向移動(dòng)，這種效應(yīng)稱(chēng)為藍(lán)移（紫移）效應(yīng)。這些會(huì)使某化合物的最大吸收波長(zhǎng)向短波方向移動(dòng)的基團(tuán)（如-CH2、-CH2CH3、-OCOCH3）稱(chēng)為向藍(lán)（紫）基團(tuán)。2023/4/3表3.3助色團(tuán)在飽和化合物中的吸收峰助色團(tuán)化合物溶劑max/m

max/(L.mol-1.cm-1)

--CH4,C2H6氣態(tài)150,165___---OHCH3OH正己烷177200---OHC2H5OH正己烷186___---ORC2H5OC2H5氣態(tài)1901000---NH2CH3NH2--173213---NHRC2H5NHC2H5正己烷1952800---SHCH3SH乙醇1951400---SRCH3SCH3乙醇210,2291020,140---ClCH3Cl正己烷173200---BrCH3CH2CH2Br正己烷208300---ICH3I正己烷2594002023/4/3(三)、吸收帶1．R吸收帶

R帶是由化合物的n-π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶,它具有雜原子和雙鍵的共軛基團(tuán).例如:＞C=O，--NO，--NO2,--N=N--，--C=S等。其特點(diǎn)是：n-π*躍遷的能量最小,，處于長(zhǎng)波方向，一般λmax在270nm以上；但躍遷幾率小，吸收強(qiáng)度弱，一般ε＜100L·mol-1·cm-1。例如：

CH3NO2λmax=280nmεmax=22R帶2023/4/33．B吸收帶

B帶是由苯環(huán)本身振動(dòng)及閉合環(huán)狀共軛雙鍵π-π*躍遷而產(chǎn)生的吸收帶，是芳香族（包括雜環(huán)芳香族）的主要特征吸收帶。其特點(diǎn)是：在230～270nm呈現(xiàn)一寬峰，且具有精細(xì)結(jié)構(gòu)，λmax=255nm，εmax約200，屬弱吸收,常用來(lái)識(shí)別芳香族化合物。但在極性溶劑中測(cè)定或苯環(huán)上有取代基時(shí)，精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。

4．E吸收帶

E帶也是芳香族化合物的特征吸收譜帶，可以認(rèn)為是苯環(huán)內(nèi)三個(gè)乙烯基共軛發(fā)生的π-π*躍遷所發(fā)生的。E帶可分為E1和E2二個(gè)吸收帶。E1帶的吸收峰大約在180nm（ε＞104）；E2帶約在200nm（ε<7000），都屬?gòu)?qiáng)吸收。El帶是觀察不到的，當(dāng)苯環(huán)上有生色團(tuán)取代且與苯環(huán)共軛時(shí)，E2帶常與K帶合并，吸收峰向長(zhǎng)波移動(dòng)，例如苯乙酮為2023/4/3K帶：λmax=240nm，ε=13000B帶：λmax=278nm，ε=1100R帶：λmax=319nm，ε=50圖3.3苯乙酮的紫外吸收光譜溶劑正庚烷圖3.4苯蒸氣的吸收曲線

250300350432KBR/nmlg2023/4/3四、溶劑對(duì)紫外吸收光譜的影響1.溶劑的極性對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的影響吸收帶正己烷CH3ClCH3OHH2O波長(zhǎng)位移→*λmax

/nm230238237243紅移n→*λmax

/nm329315309305紫移一般來(lái)說(shuō),隨著溶劑極性增大,

→*躍遷吸收峰紅移,n→*躍遷吸收峰紫移。表3.4溶劑對(duì)亞異丙酮吸收帶的影響2023/4/3表3.5常用紫外—可見(jiàn)測(cè)定的溶劑溶劑使用波長(zhǎng)范圍/nm溶劑使用波長(zhǎng)范圍/nm水>210甘油>230乙醇>210氯仿>245甲醇>210四氯化碳>265異丙醇>210乙酸甲酯>260正丁醇>210乙酸乙酯>26096%硫酸>210乙酸正丁酯>260乙醚>220苯>280二氧六環(huán)>230甲苯>285二氯甲烷>235吡啶>303己烷>200丙酮>330環(huán)己烷>200二硫化碳>3752023/4/3二、無(wú)機(jī)化合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

產(chǎn)生無(wú)機(jī)化合物紫外、可見(jiàn)吸收光譜的電子躍遷形式，一般分為兩大類(lèi)：電荷遷移躍遷和配位場(chǎng)躍遷。（一）電荷遷移躍遷

無(wú)機(jī)配合物有電荷遷移躍遷產(chǎn)生的電荷遷移吸收光譜。在配合物的中心離子和配位體中，當(dāng)一個(gè)電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關(guān)的軌道上時(shí)，可產(chǎn)生電荷遷移吸收光譜。2023/4/3

不少過(guò)渡金屬離子與含生色團(tuán)的試劑反應(yīng)所生成的配合物以及許多水合無(wú)機(jī)離子，均可產(chǎn)生電荷遷移躍遷。此外，一些具有d10電子結(jié)構(gòu)的過(guò)渡元素形成的鹵化物及硫化物，如AgBr、HgS等，也是由于這類(lèi)躍遷而產(chǎn)生顏色。電荷遷移吸收光譜出現(xiàn)的波長(zhǎng)位置，取決于電子給予體和電子接受體相應(yīng)電子軌道的能量差。例如:SCN-電子親和力比Cl-小,Fe3+-SCN-絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)大于Fe3+-Cl-絡(luò)合物,前者在可見(jiàn)光區(qū),后者在紫外區(qū)。2023/4/3(三)金屬離子影響下的配位體

→*躍遷配位體的配位場(chǎng)越強(qiáng),d軌道分裂能就越大,吸收峰波長(zhǎng)就越短.例如,H2O的配位場(chǎng)強(qiáng)度小于NH3的配位場(chǎng)強(qiáng)度,所以Cu2+的水合離子呈淺藍(lán)色,吸收峰794nm處,而它的氨合離子呈深藍(lán)色,吸收峰在663nm處。一些常見(jiàn)配位體配位場(chǎng)強(qiáng)弱順序?yàn)椋篒－＜Br－＜Cl－＜OH－＜Ｃ2Ｏ42－＝Ｈ2Ｏ＜SCN－＜吡啶＝NH3

＜乙二胺＜聯(lián)吡啶＜鄰二氮菲＜NO2－＜CN－

吸收光度法所使用的顯色劑絕大多數(shù)都含有生色團(tuán)及助色團(tuán),其本身為有色化合物.當(dāng)與金屬離子配位時(shí),作為配位體的顯色劑,其共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,導(dǎo)致其吸收光譜藍(lán)移或紅移。2023/4/3三、光譜吸收曲線(一)朗伯一比耳定律

朗伯一比耳定律是光吸收的基本定律．它指出：光被透明介質(zhì)吸收的比例與入射光的強(qiáng)度無(wú)關(guān)；在光程上每等厚層介質(zhì)吸收相同比例值的光。用數(shù)學(xué)式表達(dá)為：

I/I0=10-abc

或lgI0/I=abc其中a吸收系數(shù)，b液層厚度，c溶液濃度；吸光度A=abc如果濃度c的單位是百分濃度（g/100mL），b的單位用cm，則上式中的吸光系數(shù)用符號(hào)E1%1cm表示，稱(chēng)為比吸光系數(shù)。2023/4/3飽和烴的取代衍生物如鹵代烴，其鹵素原子上存在n電子，可產(chǎn)生n*的躍遷。n*的能量低于*。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n*躍遷分別出現(xiàn)在173、204和258nm處。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，顯示了助色團(tuán)的助色作用。直接用烷烴和鹵代烴的紫外吸收光譜分析這些化合物的實(shí)用價(jià)值不大。但是它們是測(cè)定紫外和可見(jiàn)吸收光譜的良好溶劑。2023/4/3（二）不飽和烴及共軛烯烴

在不飽和烴類(lèi)分子中，除含有鍵外，還含有鍵，它們可以產(chǎn)生*和*兩種躍遷。*躍遷的能量小于*躍遷。例如，在乙烯分子中，*躍遷最大吸收波長(zhǎng)為180nm。在不飽和烴類(lèi)分子中，當(dāng)有兩個(gè)以上的雙鍵共軛時(shí)，隨著共軛系統(tǒng)的延長(zhǎng)，*躍遷的吸收帶將明顯向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。在共軛體系中，*躍遷產(chǎn)生的吸收帶又稱(chēng)為K帶。2023/4/3（三）羰基化合物

羰基化合物含有C=O基團(tuán)。C=O基團(tuán)主要可產(chǎn)生*、n*、n*三個(gè)吸收帶。n*吸收帶又稱(chēng)R帶，落于近紫外或紫外光區(qū)。醛、酮、羧酸及羧酸的衍生物，如酯、酰胺等，都含有羰基。由于醛酮這類(lèi)物質(zhì)與羧酸及羧酸的衍生物在結(jié)構(gòu)上的差異，因此它們n*吸收帶的光區(qū)稍有不同。

羧酸及羧酸的衍生物雖然也有n*吸收帶，但是，羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接連結(jié)含有未共用電子對(duì)的助色團(tuán)，如--OH、--Cl、--OR等，2023/4/3（四）芳香族化合物

苯有三個(gè)吸收帶，它們都是由*躍遷引起的。E1帶出現(xiàn)在180nm（max=60，000）；E2帶出現(xiàn)在204nm（max=8，000）；B帶出現(xiàn)在255nm（max=200）。在氣態(tài)或非極性溶劑中，苯及其許多同系物的B譜帶有許多的精細(xì)結(jié)構(gòu)，這是由于振動(dòng)躍遷在基態(tài)電子的躍遷上的疊加而引起的。在極性溶劑中，這些精細(xì)結(jié)構(gòu)消失。當(dāng)苯環(huán)上有取代基時(shí)，苯的三個(gè)特征譜帶都會(huì)發(fā)生顯著的變化，其中影響較大的是E2帶和B譜帶。由于這些助色團(tuán)上的n電子與羰基雙鍵的電子產(chǎn)生n共軛，導(dǎo)致*軌道的能級(jí)有所提高，但這種共軛作用并不能改變n軌道的能級(jí)，因此實(shí)現(xiàn)n*

躍遷所需的能量變大，使n*吸收帶藍(lán)移至210nm左右。2023/4/3表3.6苯及其衍生物的吸收光譜化合物E吸收帶B吸收帶R吸收帶maxmaxmaxmaxmaxmaxnmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1苯2047900254204甲苯2067000261225苯酚21062002701450苯甲酸23011600273970苯胺23086002871430苯乙烯24814000282750苯甲醛2491140032050硝基苯268110003302002023/4/3（五）稠環(huán)芳烴及雜環(huán)化合物

稠環(huán)芳烴，如萘、蒽、芘等，均顯示苯的三個(gè)吸收帶，但是與苯本身相比較，這三個(gè)吸收帶均發(fā)生紅移，且強(qiáng)度增加。隨著苯環(huán)數(shù)目的增多，吸收波長(zhǎng)紅移越多，吸收強(qiáng)度也相應(yīng)增加。當(dāng)芳環(huán)上的-CH基團(tuán)被氮原子取代后，則相應(yīng)的氮雜環(huán)化合物（如吡啶、喹啉）的吸收光譜，與相應(yīng)的碳化合物極為相似，即吡啶與苯相似，喹啉與萘相似。此外，由于引入含有n電子的N原子，這類(lèi)雜環(huán)化合物還可能產(chǎn)生n*吸收帶。2023/4/3第四節(jié)紫外分光光度計(jì)一、組成部件

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是由五個(gè)部分組成：即光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和信號(hào)指示系統(tǒng)。圖3.6紫外分光光度計(jì)2023/4/3（一）光源

對(duì)光源的基本要求是應(yīng)在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射、有足夠的輻射強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長(zhǎng)的變化應(yīng)盡可能小。分光光度計(jì)中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源兩類(lèi)。熱輻射光源用于可見(jiàn)光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340~2500nm。這類(lèi)光源的輻射能量與施加的外加電壓有關(guān)，在可見(jiàn)光區(qū)，輻射的能量與工作電壓4次方成正比。光電流與燈絲電壓的n次方（n1）成正比。因此必須嚴(yán)格控制燈絲電壓，儀器必須配有穩(wěn)壓裝置。2023/4/3在近紫外區(qū)測(cè)定時(shí)常用氫燈和氘燈。它們可在160~375nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源，其光譜分布與氫燈類(lèi)似，但光強(qiáng)度比相同功率的氫燈要大3~5倍。（二）單色器單色器是能從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長(zhǎng)且波長(zhǎng)在紫外可見(jiàn)區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件，起分光的作用。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測(cè)定的靈敏度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。能起分光作用的色散元件主要是棱鏡和光柵。2023/4/3

棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據(jù)不同的波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)有不同的折射率而將不同波長(zhǎng)的光分開(kāi)。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350~3200nm的波長(zhǎng)范圍，即只能用于可見(jiàn)光域內(nèi)。石英棱鏡可使用的波長(zhǎng)范圍較寬，可從185~4000nm，即可用于紫外、可見(jiàn)和近紅外三個(gè)光域。光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見(jiàn)及紅外光域，而且在整個(gè)波長(zhǎng)區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。它具有色散波長(zhǎng)范圍寬、分辨本領(lǐng)高、成本低、便于保存和易于制備等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是各級(jí)光譜會(huì)重疊而產(chǎn)生干擾。

2023/4/3入射、出射狹縫，透鏡及準(zhǔn)光鏡等光學(xué)元件中狹縫在決定單色器性能上起重要作用。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過(guò)小的狹縫又會(huì)減弱光強(qiáng)。（三）吸收池吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見(jiàn)光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見(jiàn)光區(qū)。為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測(cè)定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對(duì)。因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L(zhǎng)度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。2023/4/3（四）檢測(cè)器檢測(cè)器的功能是檢測(cè)信號(hào)、測(cè)量單色光透過(guò)溶液后光強(qiáng)度變化的一種裝置。常用的檢測(cè)器有光電池、光電管和光電倍增管等。硒光電池對(duì)光的敏感范圍為300~800nm，其中又以500~600nm最為靈敏。這種光電池的特點(diǎn)是能產(chǎn)生可直接推動(dòng)微安表或檢流計(jì)的光電流，但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于低檔的分光光度計(jì)中。光電管在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上應(yīng)用較為廣泛。光電倍增管是檢測(cè)微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電管要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對(duì)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。2023/4/3（五）信號(hào)指示系統(tǒng)它的作用是放大信號(hào)并以適當(dāng)方式指示或記錄下來(lái)。常用的信號(hào)指示裝置有直讀檢流計(jì)、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動(dòng)記錄裝置等。很多型號(hào)的分光光度計(jì)裝配有微處理機(jī)，一方面可對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2023/4/3二、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的類(lèi)型

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的類(lèi)型很多，但可歸納為三種類(lèi)型，即單光束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)。1，單光束分光光度計(jì)經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種簡(jiǎn)易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。2，雙光束分光光度計(jì)經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光，一束通過(guò)參比池，一束通過(guò)樣品池。2023/4/3光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長(zhǎng)的函數(shù)記錄下來(lái)。雙光束分光光度計(jì)一般都能自動(dòng)記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時(shí)分別通過(guò)參比池和樣品池，還能自動(dòng)消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。3，雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過(guò)兩個(gè)單色器，得到兩束不同波長(zhǎng)（1和2）的單色光，利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后2023/4/3經(jīng)過(guò)光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度差值ΔA（ΔA=A1-A2）。對(duì)于多組分混合物、混濁試樣（如生物組織液）分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長(zhǎng)分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長(zhǎng)工作方式。如果能在1和2處分別記錄吸光度隨時(shí)間變化的曲線，還能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。2023/4/3光閘單色器斬波器參比光電倍增管圖3.8單光束分光光度計(jì)原理圖光電倍增管斬波器光閘試樣單色器圖3.9雙光束分光光度計(jì)原理圖2023/4/3單色器單色器吸收池接收器λ1λ1λ2λ2圖3.7雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)原理圖2023/4/3三、分光光度計(jì)的校正

通常在實(shí)驗(yàn)室工作中，驗(yàn)收新儀器或?qū)嶒?yàn)室使用過(guò)一段時(shí)間后都要進(jìn)行波長(zhǎng)校正和吸光度校正。建議采用下述的較為簡(jiǎn)便和實(shí)用的方法來(lái)進(jìn)行校正：鐠銣玻璃或鈥玻璃都有若干特征的吸收峰，可用來(lái)校正分光光度計(jì)的波長(zhǎng)標(biāo)尺，前者用于可見(jiàn)光區(qū)，后者則對(duì)紫外和可見(jiàn)光區(qū)都適用。也可用K2CrO4標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)校正吸光度標(biāo)度。2023/4/3第五節(jié)紫外吸收光譜的應(yīng)用一紫外吸收光譜法在有機(jī)定性分析中的應(yīng)用紫外吸收光譜最主要的應(yīng)用是在有機(jī)化合物的定性、定量分析方面，例如化合物的鑒定、結(jié)構(gòu)分析和純度檢查等，在藥物、天然化合物中應(yīng)用較多。（一）化合物的鑒定有機(jī)化合物的鑒定，一般采用光譜比較法。即將外知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀（極大、極小和拐點(diǎn)），與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。為了便于比較，吸收光譜常以lgA對(duì)λ作圖，此時(shí)朗伯—比爾定律可寫(xiě)成lgA=lgk+lgbc2023/4/3式右邊只有k隨波長(zhǎng)變化。因此，即使?jié)舛萩和吸收池厚度b不同，也只使吸收曲線上下移動(dòng)，并不影響形狀。若未知化合物和純已知化合物的吸收光譜非常一致，則可認(rèn)為就是同一種化合物。但是，由于大多數(shù)有機(jī)化合物的紫外—可見(jiàn)光譜比較簡(jiǎn)單，譜帶寬且缺乏精細(xì)結(jié)構(gòu)，特征性不明顯，而且很多生色團(tuán)的吸收峰幾乎不受分子中其它非吸收基團(tuán)的影響，因此，僅依靠紫外光譜數(shù)據(jù)來(lái)鑒定未知化合物具有較大的局限性，必須與其他方法如紅外光譜法、核磁共振波譜法等相配合，才能對(duì)未知化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。（二）結(jié)構(gòu)分析

紫外吸收光譜雖然不能對(duì)一種化合物作出準(zhǔn)確鑒定，但對(duì)化合物中官能團(tuán)和共軛體系的推測(cè)與確定卻是非常有效的。一般有以下規(guī)律：2023/4/3（1）在220～280nm范圍內(nèi)無(wú)吸收，可推斷化合物不含苯環(huán)、共軛雙鍵、醛基、酮基、溴和碘（飽和脂肪族溴化物在220～210nm有吸收）。（2）在210～250nm有強(qiáng)吸收，表示含有共軛雙鍵，如在260nm、300nm、330nm左右有高強(qiáng)度吸收峰，則化合物含有3～5個(gè)共軛π鍵。（3）在270～300nm區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)隨溶劑極性增大而向短波方向移動(dòng)的弱吸收帶，表明有羥基存在。（4）在約260nm處有具有振動(dòng)精細(xì)結(jié)構(gòu)的弱吸收帶則說(shuō)明有苯環(huán)存在。（5）如化合物有許多吸收峰，甚至延伸到可見(jiàn)光區(qū)，則可能為多環(huán)芳烴。2023/4/3紫外—可見(jiàn)吸收光譜也可以用來(lái)作同分異構(gòu)體的判別。例如，下面兩種化和物：

(Ⅰ)(Ⅱ)用化學(xué)方法只能測(cè)出它們各含有兩個(gè)羰基，但二者的紫外光譜卻有很大差別。化合物（Ⅰ）在270nm處有最大吸收，吸收峰位置與丙酮相同而強(qiáng)度差不多是丙酮的兩倍?；衔铮á颍┯捎趦蓚€(gè)碳氧雙鍵共軛，吸收峰出現(xiàn)在400nm左右。2023/4/3再如，乙酰乙酸乙酯存在下述酮—烯醇互變異構(gòu)體：

酮式烯醇式酮式?jīng)]有共軛雙鍵，它在204nm處僅有弱吸收；而烯醇式由于有共軛雙鍵，因此在245nm處有強(qiáng)的K吸收帶（κ=18000L·mol-1cm-1)。2023/4/3

例如，在順式肉桂酸和反式肉桂酸中，順式空間位阻大，苯環(huán)與側(cè)鏈雙鍵共平面性差，不易產(chǎn)生共軛；反式空間位阻小，雙鍵與苯環(huán)在同一平面上，容易產(chǎn)生共軛。因此，反式的最大吸收波長(zhǎng)λmax=295nm（εmax=7000），而順式的最大吸收波長(zhǎng)λmax=280nm（εmax=13500）

采用紫外光譜法，還可以測(cè)定某些化合物的互變異構(gòu)現(xiàn)象。例如，乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式間的互變異構(gòu)：2023/4/3圖3.10酮式與水形成分子間氫鍵烯醇式形成分子內(nèi)氫鍵2023/4/3在極性溶劑中，最大吸收波長(zhǎng)λmax=272nm(εmax=16)，說(shuō)明該峰由n—π*躍遷引起，所以在極性溶劑中，該化合物應(yīng)以酮式存在。相反，在非極性的正己烷中，出現(xiàn)λmax=243nm的強(qiáng)峰，這說(shuō)明在非極性溶劑中，形成了分子內(nèi)氫鍵，故是以烯醇式為主。2023/4/3二、定量分析

用已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成一系列不同濃度的溶液，在一定的實(shí)驗(yàn)條件和合適的波長(zhǎng)下，分別測(cè)定其吸光度，然后以吸光度相對(duì)于物質(zhì)的濃度作圖，得一吸光度與濃度的校正曲線圖。理想的校正曲線應(yīng)為通過(guò)原點(diǎn)的直線，利用該線性關(guān)系，就能求得待測(cè)組份中該物質(zhì)的含量。2023/4/3

（一）解聯(lián)立方程組的方法

圖3.11吸光度與濃度的校正曲線圖2023/4/3（二）雙波長(zhǎng)分光光度法

1、等吸收波長(zhǎng)法當(dāng)混合組份的吸收曲線是如圖所示的情況時(shí)，除用解二元一次方程組的方法測(cè)定外，還可采用等吸收波長(zhǎng)法。

為了消除干擾組份的吸收，一般采用作圖法確定干擾組份的等吸收波長(zhǎng)。圖中是混合試樣中A、B兩組份的吸收曲線，其中A是干擾組份，B是待測(cè)組份。在用作圖法選擇波長(zhǎng)時(shí)，可將測(cè)定波長(zhǎng)λ2選在被測(cè)組份B的吸收峰處（或其附近），而參比波長(zhǎng)λ1的選擇，應(yīng)考慮能消除干擾物質(zhì)的吸收，即使A組份在λ1的吸光度等于它在λ2的吸光度（Aλ1=Aλ2）。2023/4/3根據(jù)吸光度的加和原則，混合物在λ1和λ2處的吸光度分別為：

Aλ1=AAλ1+ABλ1Aλ2=AAλ2+ABλ2△A=Aλ2-Aλ112ABA圖3.12A、B吸收曲線2023/4/3雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)的輸出信號(hào)是：△A=AAλ2+ABλ2-AAλ1-ABλ1由于雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)使用同一光源，即λ1及λ2強(qiáng)度相等，根據(jù)AAλ2=AAλ1，所以△A=AAλ2+ABλ2-AAλ1-ABλ1=ABλ2-ABλ1輸出信號(hào)△A與干擾組份無(wú)關(guān)，它正比于B組份的濃度c，這樣就消除了干擾組份的影響。2023/4/3

2、系數(shù)倍率法當(dāng)干擾組份A不存在吸光度相等的兩個(gè)波長(zhǎng)時(shí)，采用上述方法不能測(cè)量B組份的含量，如圖所示，此時(shí)，可采用系數(shù)倍率法測(cè)定。設(shè)A組份在λ1和λ2的吸光度分別為AAλ1和AAλ2，則倍率系數(shù)K=AAλ2/AAλ1，若使用倍率系數(shù)儀將AAλ1的值擴(kuò)大K倍，則有KAAλ1=AAλ2，此時(shí)，KAAλ1-AAλ2=0，與等吸收波長(zhǎng)法類(lèi)似，A組份的干擾被消除。這種方法也可以用于測(cè)定含有三種組份的混合樣品。2023/4/3圖3.13吸收曲線ABBA2023/4/3

3、雙波長(zhǎng)法測(cè)定混濁樣品在用雙光束法測(cè)定混濁樣品時(shí)，由于參比溶劑不像樣品那樣混濁，因此測(cè)量時(shí)不能消除樣品混濁產(chǎn)生的背景吸收。在雙波長(zhǎng)法測(cè)定中，若將λ2設(shè)在樣品的吸收峰上，λ1設(shè)在樣品無(wú)特征吸收的波長(zhǎng)上，此時(shí)λ1和λ2處的背景吸收應(yīng)相等。顯然，λ2上測(cè)得的是樣品本身的吸收與背景吸收的總和，λ1測(cè)得的是背景吸收，因此，用雙波長(zhǎng)法可以消除樣品混濁產(chǎn)生的背景吸收。由于消除背景后的樣品吸收與其濃度成正比，因此可對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。2023/4/3（三）導(dǎo)數(shù)分光光度法

1）能夠分辨兩個(gè)或兩個(gè)以上完全重疊或以很小波長(zhǎng)差相重疊的吸收峰。當(dāng)兩個(gè)峰的峰高與半寬度的比值不相同時(shí)，則可認(rèn)為它們的尖銳程度不同。圖中兩個(gè)尖銳程度不同的吸收峰1和峰2在同一波長(zhǎng)處相互重疊，疊加成吸收峰3，從吸收峰3的外形，很難辨別出它是由兩個(gè)吸收峰疊加而成的，如果將其透光率曲線4進(jìn)行一次求導(dǎo)，就得到如曲線5所示的導(dǎo)數(shù)光譜線。在曲線的正負(fù)兩個(gè)方向上，各出現(xiàn)兩個(gè)導(dǎo)數(shù)光譜峰，從而很容易地辨認(rèn)出來(lái)。2023/4/3圖3.14導(dǎo)數(shù)光譜（從透光率求得）2023/4/3（2）能夠分辨吸光度隨波長(zhǎng)急劇上升時(shí)所掩蓋的弱的吸收峰。通常，當(dāng)一個(gè)弱峰處于強(qiáng)峰的吸光度急劇上升處時(shí)，檢出很困難。而導(dǎo)數(shù)光譜能提高分辨能力，一般經(jīng)過(guò)數(shù)次求導(dǎo)后，有可能分辨出疊加在強(qiáng)峰肩部的弱峰。（3）能夠確認(rèn)寬闊吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)。

2023/4/3紫外光譜在高分子中的應(yīng)用1.聚合物老化性能研究2.共聚物中有紫外吸收嵌段含量的確定3.吸附分離材料中芳香成分的確定4.聚合物結(jié)構(gòu)的確定5.紫外自修復(fù)材料2023/4/32023/4/3分子發(fā)光―熒光、磷光光譜法

Molecularfluorescence

Molecularphosphorescence

2023/4/3簡(jiǎn)介

分子發(fā)光屬于發(fā)射光譜范疇，包括分子熒光、分子磷光和化學(xué)發(fā)光。分子熒光和分子磷光屬于光致發(fā)光，但是熒光發(fā)射，在電子能量變化中不涉及電子自旋的改變，熒光的壽命較短，為10－5s；磷光發(fā)射，在電子能量變化中伴隨電子自旋的改變，磷光的壽命較長(zhǎng)，為為幾秒，甚至更長(zhǎng)?；瘜W(xué)發(fā)光基于在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，生成了能產(chǎn)生發(fā)射光譜的激發(fā)態(tài)物質(zhì)。產(chǎn)生的光譜不一定是被分析物本身的光譜，而往往是被分析物反應(yīng)生成物質(zhì)的光譜；有時(shí)被分析物作為抑制劑或催化劑。2023/4/3第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，他于1575年提到，在含有一種稱(chēng)為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)可愛(ài)的藍(lán)色。以后逐步有一些學(xué)者也觀察和描述過(guò)熒光現(xiàn)象，但對(duì)其本質(zhì)及含義的認(rèn)識(shí)都沒(méi)有明顯的進(jìn)展，直到1852年，對(duì)熒光分析法具有開(kāi)拓性工作的Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍為長(zhǎng)些，而不是由光的漫反射引起的，從而導(dǎo)入熒光是光發(fā)射的概念，并提出了“熒光”這一術(shù)語(yǔ)，他還研究了熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度之間的關(guān)系，并描述了在高濃度或某些外來(lái)物質(zhì)有在時(shí)的熒光猝滅現(xiàn)象?？梢哉f(shuō)，他是第一個(gè)提出應(yīng)用熒光作為分析手段的人。1867年，Goppelsrode應(yīng)用鋁一桑色素色素配位化合物的熒光測(cè)定鋁，這是歷史上首次進(jìn)行的熒光分析工作。2023/4/3磷光也是某些物質(zhì)受紫外光照射后產(chǎn)生的光。1944年Lewis和Kasha提出了磷光與熒光的不同概念，指出磷光是分子從亞穩(wěn)的激發(fā)三重態(tài)躍遷回基態(tài)所發(fā)射出的光，它有別于從激發(fā)單態(tài)躍遷回基態(tài)所發(fā)射的熒光。磷光分析法由于其有某些特點(diǎn)，幾十年來(lái)的理論研究及應(yīng)用也不斷得到發(fā)展。進(jìn)入二十世紀(jì)以后，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，在理論或?qū)嶒?yàn)技術(shù)上都得到極大的發(fā)展。特別是隨著激光、計(jì)算機(jī)和電子學(xué)的新成就及技術(shù)的引入，大大推動(dòng)了熒光分析法在理論上及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的理論和新的方法。2023/4/32008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)由日本科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢(qián)永健獲得，是因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白（GFP）方面做出重大貢獻(xiàn)，將平分諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1000萬(wàn)瑞典克朗（約合140萬(wàn)美元）。

2023/4/3§11－1分子熒光和磷光光譜法1．產(chǎn)生機(jī)理在一般溫度下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。處于基態(tài)的分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能等到)后天激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)是很不穩(wěn)定的，它得很快地釋放出能量又重新躍遷回基態(tài)。若分子返回基態(tài)時(shí)以發(fā)射的電磁輻射(即光)的形式釋放能量，就稱(chēng)為“發(fā)光”；如果物質(zhì)的分子吸收了光能而被激發(fā)，躍遷回基態(tài)所發(fā)射的電磁輻射，稱(chēng)為熒光和磷光?，F(xiàn)從分子結(jié)構(gòu)理論來(lái)討論熒光和磷光的產(chǎn)生機(jī)理。2023/4/32023/4/3無(wú)輻射躍遷☆振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程，其效率較高。☆內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級(jí)間，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的分子內(nèi)過(guò)程。

☆系間竄越：

激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過(guò)程?！钔廪D(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑與其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)換而使熒光

（或磷光）減弱甚至消失的過(guò)程。熒光強(qiáng)度的減弱或消失，稱(chēng)為熒光熄滅（或猝滅）

。2023/4/3分子熒光、磷光分光光度法，是一種發(fā)射光譜法。其分析過(guò)程是：用一定波長(zhǎng)的光(激發(fā)光)照射試樣溶液，試樣溶液中吸收光子的分子(激發(fā)態(tài)分子)，發(fā)射相同或較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光(熒光)；若約經(jīng)過(guò)10-6秒或更長(zhǎng)的時(shí)間，發(fā)射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光(磷光)。處于分子基態(tài)單重態(tài)的分子軌道上的電子是配對(duì)的，而且自旋相反；當(dāng)其中的一個(gè)電子被激發(fā)，躍遷至第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)，或更高激發(fā)單重態(tài)，電子自旋方向不變；通過(guò)內(nèi)部轉(zhuǎn)換回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射光子回基態(tài)，產(chǎn)生熒光。2023/4/3處于分子基態(tài)單重態(tài)的分子軌道上的電子，激發(fā)時(shí)不能直接躍遷至第一激發(fā)三重態(tài)軌道上（不符合光譜選擇定則），但處于單重激發(fā)態(tài)的軌道上的電子，可以通過(guò)體系跨越（系間竄躍），轉(zhuǎn)移到三重態(tài)軌道上；在這個(gè)過(guò)程中，處于激發(fā)態(tài)的電子自旋發(fā)生變化，這個(gè)過(guò)程需要時(shí)間較長(zhǎng)，故處于三重激發(fā)態(tài)的壽命為10－4~1s；當(dāng)其由三重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生磷光。單重態(tài)分子是抗磁性的；三重態(tài)分子是順磁性的。2023/4/32023/4/32．熒光光譜的特點(diǎn)：

熒光光譜的形狀與激發(fā)光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)——因?yàn)闊晒饪偸菑牡谝患ぐl(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)發(fā)射的；熒光光譜的形狀與激發(fā)光譜的形狀十分相似，互為鏡像（鏡面對(duì)稱(chēng)）；

一般說(shuō)來(lái)，熒光的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒光大多數(shù)是π＊-π躍遷產(chǎn)生的，幾乎所有熒光體系都含有一個(gè)以上的芳香基團(tuán)；此外作為熒光顯色劑還含有兩個(gè)成絡(luò)基團(tuán)。

一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)都是含有π鍵或n電子的物質(zhì)。2023/4/33．熒光強(qiáng)度If=

I0εbc＝Kc

定量關(guān)系式2023/4/3量子化效率熒光的量子化效率，與過(guò)程中速度常數(shù)有關(guān)，且為：2023/4/34．熒光、磷光與化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系①具有剛性結(jié)構(gòu)和平面結(jié)構(gòu)的π電子共軛體系，隨π電子共軛度和分子平面度的增大，熒光量子化效率增大，熒光光譜向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。ph(CH=CH)3ph,ph(CH=CH)2ph的熒光量子化效率分別為0.68和0.28。②熒光物質(zhì)的剛性和共平面性的增加，減小了熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用，使外轉(zhuǎn)移的能量減小，有利于熒光；芴與聯(lián)二苯的熒光效率分別為1.0和0.2。③芳香化合物上的取代基會(huì)使該化合物的最大吸收波長(zhǎng)和熒光峰改變，不同取代基的作用不同。④鹵素取代隨鹵原子的序數(shù)增加，熒光下降，磷光增強(qiáng)。這是所謂的重原子效應(yīng)。改變了自旋軌道的相互作用，增加了由單重激發(fā)態(tài)向三重激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變的速度。2023/4/35．影響光致發(fā)光的因素（1）溶劑的影響隨著溶劑介電常數(shù)（極性）的增大，熒光峰的波長(zhǎng)增長(zhǎng)，熒光效率增大。含有重原子的溶劑，有重原子效應(yīng)，使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。溶劑中的雜質(zhì)熒光光譜或溶劑的拉曼光譜干擾測(cè)定?；蜻x用高分辨率的儀器，或?qū)θ軇┻M(jìn)行空白測(cè)定給予校正。2023/4/3（2）溫度影響一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨其溶液的溫度升高熒光效率降低。因此，熒光和磷光分析常在低溫下進(jìn)行，特別是磷光的測(cè)定。（3）pH的影響當(dāng)熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH值強(qiáng)烈地影響其熒光強(qiáng)度和熒光光譜的形狀和發(fā)射波長(zhǎng)。這里關(guān)鍵是分子狀態(tài)還是離子狀態(tài)有熒光。（4）熒光的熄滅熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，稱(chēng)為熒光熄滅。使熒光熄滅的因素很多：①碰撞熄滅；②能量轉(zhuǎn)移；③氧的熄滅作用；④自熄滅和自吸收。2023/4/3熒光和磷光均屬于光致發(fā)光，所以都涉用到兩種輻射，即激發(fā)光(吸收)和發(fā)射光，因而也都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜，是通過(guò)掃描激發(fā)單色器，使不同波長(zhǎng)的入射光照射熒光(磷光)體，對(duì)其所發(fā)出的熒光(磷光)通過(guò)固定波長(zhǎng)的發(fā)射單色器，照射到檢測(cè)器上，檢測(cè)其熒光(磷光)強(qiáng)度，由此得到光強(qiáng)度對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。發(fā)射光譜，也稱(chēng)熒光光譜或磷光光譜，是固定激光發(fā)光的波長(zhǎng)，掃描發(fā)射的光的波長(zhǎng)，記錄發(fā)射光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，即為發(fā)射光譜。通過(guò)發(fā)射光譜選擇最佳的發(fā)射波長(zhǎng)——發(fā)射熒光(磷光)強(qiáng)度最大的發(fā)射波長(zhǎng)，常用λem表示，磷光發(fā)射波長(zhǎng)比熒光來(lái)得長(zhǎng)。6.激發(fā)光譜與熒光（磷光）光譜2023/4/3激發(fā)光譜與熒光、磷光光譜互成鏡象對(duì)稱(chēng)，如菲的激發(fā)光譜、熒光、磷光光譜。2023/4/32023/4/3熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的特征（1）斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)波長(zhǎng)，Stokes于1852年首次發(fā)現(xiàn)這種波長(zhǎng)位移現(xiàn)象，故稱(chēng)Stokes位移。斯托克斯位移說(shuō)明了在激發(fā)與發(fā)射之間存大著一定的能量損失。激發(fā)態(tài)分子由于振動(dòng)弛豫及內(nèi)都轉(zhuǎn)移的無(wú)輻射躍遷而迅速衰變到S1電子態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，這是產(chǎn)生其位移的主要原因；其次，熒光發(fā)射時(shí)，激發(fā)態(tài)的分子衰變到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，此時(shí)，不同振動(dòng)能級(jí)也發(fā)生振動(dòng)弛豫至最低振動(dòng)能級(jí)，也造成能量的損失；第三，溶劑效應(yīng)和激發(fā)態(tài)分子可能發(fā)生的某些反應(yīng)，也會(huì)加大斯托克斯位移。（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)：由于熒光發(fā)射是激發(fā)態(tài)的分子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷回基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)所產(chǎn)生的，所以不管激發(fā)光的能量多大，能把電子激發(fā)到種激發(fā)態(tài)，都將經(jīng)過(guò)司迅速的振動(dòng)弛豫及內(nèi)部轉(zhuǎn)移躍遷至第一激發(fā)單重態(tài)的最低能級(jí)，然后發(fā)射熒光。2023/4/3（3）熒光激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)關(guān)：

由于在稀溶液中，熒光發(fā)射的效率(稱(chēng)為量子產(chǎn)率)與激發(fā)光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，因此用不同發(fā)射波長(zhǎng)繪制激發(fā)光譜時(shí)，激發(fā)光譜的形狀不變，只是發(fā)射強(qiáng)度不同而已。（4）熒光激發(fā)光譜與吸收光譜的形狀相近似，熒光發(fā)射光譜與吸收光譜成鏡像關(guān)系：物質(zhì)的分子只有對(duì)光有吸收，才會(huì)被激發(fā)，所以，從理論上說(shuō)，某化合物的熒光激發(fā)光譜的形狀，應(yīng)與它的吸收光譜的形狀完全相同。然而實(shí)際并非如此，由于存在著測(cè)量?jī)x器的因素或測(cè)量環(huán)境的某些影響，使得絕大多數(shù)情況下，“表觀”激發(fā)光譜與吸收光譜兩者的形狀有所差別。為什么兩種光譜會(huì)互為鏡像關(guān)系呢？吸收光譜中的第一吸收帶是由于基態(tài)分子吸收光能量被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各不同振動(dòng)能級(jí)，所以，其形狀取決于第一電子激發(fā)態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布情況(即能量間隔情況)，而熒光光譜是激發(fā)態(tài)分子從第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍回基態(tài)中的各不同振動(dòng)能級(jí)所致，所以熒光光譜的形狀取決于基態(tài)中各振動(dòng)能級(jí)的分布情況。一般情況下，基態(tài)和第一電了激發(fā)單重態(tài)中振動(dòng)能級(jí)的分布情況是相同的，所以熒光發(fā)射光譜與吸收光譜的形狀是類(lèi)似的。2023/4/3發(fā)射熒光的有機(jī)化合物通常具有以下的結(jié)構(gòu)特征：（1）具有π→π*電子躍遷類(lèi)型的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)能發(fā)熒光的化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫等無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生π*→π或π*→n躍遷而產(chǎn)生熒光。（2）具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)。發(fā)生熒光(或磷光)的物質(zhì)，其分子都含有共鍵雙鍵(π鍵)的結(jié)構(gòu)體系。共軛體系越大，電子的離域性越大，越容易被激發(fā)，熒光也就越容易發(fā)生，且熒光光譜向長(zhǎng)波移動(dòng)。大部分熒光物質(zhì)都具有芳環(huán)或雜環(huán)，芳環(huán)越大，其熒光(或磷光)峰越向長(zhǎng)波移動(dòng)，且熒光強(qiáng)度往往也較強(qiáng)。（3）具在剛性平面結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物分子都具有強(qiáng)烈的熒光，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可為減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間的相互作用減少，即可減少能量外部轉(zhuǎn)移的損失，有利于熒光的發(fā)射。而且平面平面結(jié)構(gòu)可以增大分子的吸光截面，增大摩爾吸光系數(shù)，增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。例如：2023/4/32023/4/3（4）取代基的影響：取代基的性質(zhì)(尤其是發(fā)色基因)對(duì)熒光體與的熒光特性和強(qiáng)度均有強(qiáng)烈的影響。芳烴及雜環(huán)化合物的熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及熒光效率常隨取代基的不同而異，由于目前對(duì)于激發(fā)態(tài)分子的性質(zhì)了解還很不夠，尚不能真正從機(jī)制上揭開(kāi)其影響的秘密。其影響規(guī)律多出自實(shí)驗(yàn)總結(jié)和推測(cè)。

給電子取代基使熒光加強(qiáng)屬于這類(lèi)基團(tuán)的有－NH2，－NHR，－NR2，－OH，－OR，－CN等。由于這些基團(tuán)上的n電子云幾乎與芳環(huán)上的π電子軌道平行，因而實(shí)際上它們共享了共軛π電子，形成了p～π共軛，擴(kuò)大共軛體系。吸電子基團(tuán)使熒光減弱而磷光增強(qiáng)屬于這類(lèi)基團(tuán)的有如羰基(－COOH，－CHO，)，硝基(－NO2)及重氮基（-NH-N=N-）等。這類(lèi)基團(tuán)都會(huì)發(fā)生躍遷，屬于禁阻躍遷，所以摩爾吸光系數(shù)小，熒光發(fā)射也弱，而系間跨躍較為強(qiáng)烈，同樣使熒光減弱，相應(yīng)磷光增強(qiáng)。取代基位置的影響取代基位置對(duì)芳烴熒光的影響通常為：鄰位，對(duì)位取代者增熒光，間位取代者抑制熒光(－CN取代者例外)。取代基的空間阻礙對(duì)熒光也有明顯的影響。例如2023/4/32023/4/3無(wú)機(jī)物的熒光

無(wú)機(jī)化合物的熒光有無(wú)機(jī)鹽類(lèi)的熒光和金屬螯合物的熒光兩種。某些無(wú)機(jī)鹽類(lèi)的熒光:

無(wú)機(jī)化合物本身能發(fā)熒光(或磷光)的不多，常見(jiàn)的主要有鑭系元素(Ⅳ)的化合物，U(Ⅵ)化合物，類(lèi)汞離子化合物Tl(Ⅰ)Sn(Ⅱ)P(Ⅱ)As(Ⅲ)Sb(Ⅲ)Bi(Ⅲ)Se(Ⅳ)等。這些化合物在低溫(液氮)下都有較高的熒光效率和選擇性，因此常用低溫?zé)晒夥ㄟM(jìn)行測(cè)定。 金屬螯合物的熒光:無(wú)機(jī)離子與具有吸光結(jié)構(gòu)的有機(jī)試劑發(fā)生配合作用，生成會(huì)發(fā)熒光的螯合物，可以進(jìn)行熒光測(cè)定。這種能發(fā)熒光的螯合物可能是螯合物中配位體的發(fā)光，也可能是螯合物中金屬離子的發(fā)光。螯合物中配位體的發(fā)光。這一類(lèi)螯合物中金屬離子的外電子層具有與惰性氣體相同的結(jié)構(gòu)，為抗磁性的離子，它與含有芳基的有機(jī)配位體形成螯合物時(shí)多數(shù)會(huì)發(fā)射較強(qiáng)的熒光。這是因?yàn)樵瓉?lái)的配們體雖有吸收光構(gòu)型，但其最低激發(fā)單重態(tài)的S1是n→π*型，及缺乏剛性平面結(jié)構(gòu)，所以并不發(fā)熒光，而與金屬離子配合后，配位體變?yōu)樽畹图ぐl(fā)單重態(tài)的π→π*型，且由于螯合物的形成，而具有則性平面結(jié)構(gòu)，因此能發(fā)射熒光。如下列例子所示。2023/4/32023/4/3螯合物中金屬離子的熒光。這些金屬離子的次外層中具有未完滿(mǎn)電子的d軌道或f軌道，它們吸收光時(shí)，會(huì)發(fā)生d→d*或f→f*的吸收躍遷。也會(huì)發(fā)生d*→d或f*→f的發(fā)光躍遷，但躍遷機(jī)率很小，吸光及發(fā)光很弱。當(dāng)與配位體螯合時(shí)，則首先是發(fā)生配位體的π→π*吸收躍遷，而通過(guò)金屬離子的d*或f*能層在配位體激發(fā)后最低激發(fā)單重態(tài)S1能層的下方，因而可以發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，由S1轉(zhuǎn)移給d*或f*，然后發(fā)生d*→d或f*→f或躍遷，使躍遷機(jī)率增大，發(fā)光強(qiáng)度增大。2023/4/37．熒光和磷光分析儀器2023/4/3（1）激發(fā)光源激發(fā)光源應(yīng)具有足夠的強(qiáng)度、適用波長(zhǎng)范圍寬，穩(wěn)定等特點(diǎn)。常用的光源有高壓汞燈和氙弧燈。

高壓汞燈:高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)光的光源，主要有365、405、436nm的三條譜線，尤以365nm譜線最強(qiáng)，一般濾光片式的熒光計(jì)多采用它為激發(fā)光源。

氙弧燈：氙弧燈通常就叫氙燈，是目前熒光分光分度計(jì)中應(yīng)用最廣泛的一種光源。它是一種電弧氣體放電燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，溫度時(shí)其壓力為5atm，工作時(shí)壓力為20atm，具有光強(qiáng)度大，在200～800nm范圍內(nèi)是連續(xù)光源的特點(diǎn)。（2）單色器

熒光分析儀中應(yīng)用最多的單色器為光柵單色器，稱(chēng)為熒光分光光度計(jì)。光柵有兩塊，第一塊為激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光的波長(zhǎng)，第二塊為發(fā)射單色器，用于選擇熒光發(fā)射波長(zhǎng)。在比較低檔次的熒光計(jì)中，采用濾光片作為單色器。第一濾光片用的分離出所需用的激發(fā)光，第二濾光片用以濾支雜散光，瑞利光，拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。2023/4/3（3）樣品池

熒光分析的樣品池通常用石英材料做成，它與吸光分析法的液池不同在于，熒光樣品池的四面均為磨光透明面，同時(shí)一般僅有厚度為1cm的池。（4）檢測(cè)器

簡(jiǎn)易型的熒光計(jì)可用目視檢測(cè)，或用硒光電池，光電管檢測(cè)?，F(xiàn)在的熒光計(jì)多采用光電倍增管進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器的方向應(yīng)與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的于擾。在現(xiàn)代的高級(jí)儀器中，光導(dǎo)攝象管用來(lái)作為光學(xué)多道分析器的檢測(cè)器。它具有檢測(cè)效率高、動(dòng)態(tài)范圍寬、線性響應(yīng)好、堅(jiān)固耐用和壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。它的檢測(cè)靈敏敏顯不職光電倍增管，但卻能同時(shí)接受熒光體的整個(gè)發(fā)射光譜。

（5）記錄，顯示裝置

熒光儀的讀出裝置有讀字電壓表或記錄儀?，F(xiàn)代儀器都配上計(jì)算機(jī)，進(jìn)行自動(dòng)控制和顯示熒光光譜及各種參數(shù)。2023/4/3磷光分析儀與熒光分析儀的差別磷光分析儀器與磷光分析儀器同樣由五個(gè)基本部件組成，但需要有一些特殊的配件，在比較好的熒光分析儀器上都配有磷光分析的配件，因此兩種方法可以用同一儀器。磷光分析儀器與磷光分析儀器的主要區(qū)別有兩點(diǎn)。樣品池需配有冷卻裝置：

對(duì)于溶液磷光的測(cè)定，常采用低溫磷光分析法，即試樣溶液需要低溫冷凍。通常把試液裝入內(nèi)徑約1-3mm的石英細(xì)管（液池）中，然后將液池插入盛有液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)。磷光鏡：有些物質(zhì)會(huì)同時(shí)發(fā)射熒光和磷光，因此在測(cè)定磷光時(shí)，必須把熒光分離去。為此目的，可利用磷光壽命比熒光長(zhǎng)的特點(diǎn)，在激發(fā)單色器和液池之間及在發(fā)射單色器和液池之間各裝上一個(gè)斬波片，并且由一個(gè)同步馬達(dá)帶動(dòng)。這種裝置稱(chēng)為磷光鏡，它有轉(zhuǎn)角