(42)-7.2.1DNA芯片的制備與檢測

第二節(jié)DNA芯片DNA芯片（DNAchip）或DNA微陣列(DNAmicroarray）=基因芯片將大量序列已知的寡聚核苷酸探針固定在支持物上，與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，再通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱及分布，對基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究。1一、DNA芯片原理理論基礎(chǔ)：核酸雜交理論即標(biāo)記的核酸分子能夠和與之互補(bǔ)配對的核酸分子雜交。2芯片的設(shè)計與制備樣品制備雜交反應(yīng)信號檢測結(jié)果分析4芯片的設(shè)計與制備樣品制備雜交反應(yīng)信號檢測結(jié)果分析5載體（片基）：用于連接、吸附或包埋各種生物分子并使其以固相化的狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)的固相材料探針：固定在支持介質(zhì)表面的DNA，稱為探針（一）芯片的制備載體的選擇與預(yù)處理理想的載體：類型：玻璃片、塑料、硅片、微型磁珠等活化：多聚L-賴氨酸、氨基硅烷6有效的固定探針允許進(jìn)行穩(wěn)定的雜交反應(yīng)不改變檢測信號探針的點(diǎn)樣過程7原位合成（在片合成）直接點(diǎn)樣（離片合成）原位合成（insitusynthesis）將多個寡核苷酸片段用單核苷酸底物直接合成到載體的特定位置上制備的芯片，適用于大規(guī)模生產(chǎn)

光導(dǎo)原位合成法（Light-directedsynthesis）

原位噴印合成法

分子印章多次壓印合成法8光導(dǎo)原位合成法（Light-directedsynthesis）使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來每次選取擇適當(dāng)?shù)谋喂饽な剐枰酆系牟课煌腹?，其它部們不透光。光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護(hù)合成所用的單體分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應(yīng)后仍舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的9Affymetrix10光導(dǎo)原位合成法（Light-directedsynthesis）優(yōu)點(diǎn)：精確度高；合成步驟少；合成的探針陣列密度高缺點(diǎn)：成本高；合成反應(yīng)產(chǎn)率比較低，探針的長度受到了限制；雜交信號模糊11原位噴印合成法（Piezoelectricprinting）將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑所替代。支持物經(jīng)過包被后，通過計算機(jī)控制噴墨打印機(jī)將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。沖洗、去保護(hù)、偶聯(lián)等與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑?？梢院铣沙鲩L度為40到50個堿基的探針。12原位噴印合成法（Piezoelectricprinting）優(yōu)點(diǎn)：試劑簡單；靈活性高；效率高缺點(diǎn)：耗時長13分子印章多次壓印合成法分子印章類似于傳統(tǒng)的印章，其表面依照陣列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此將不同的核酸或多肽合成試劑按印到芯片片基特定位點(diǎn)進(jìn)而進(jìn)行合成反應(yīng)。選擇適當(dāng)?shù)暮铣身樞?、設(shè)計凹凸位點(diǎn)不同的印章即可在支持物上原位合成出位置和序列預(yù)定的寡核苷酸或寡肽陣列產(chǎn)率高；精確度高14直接點(diǎn)樣合成工作用傳統(tǒng)的DNA或多肽固相合成儀以完成，合成后用特殊的自動化微量點(diǎn)樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。技術(shù)成熟、方法靈活、成本低、速度快多用于大片段DNA探針的芯片制備15噴墨打印首先用微孔板裝載預(yù)先合成的DNA探針,噴頭從微孔板上吸取探針試劑后移至處理過的支持物上,通過熱敏式或聲控式噴射器的動力把液滴噴射到支持物表面16針式打印預(yù)先制備好的探針溶液常放置在96孔或384孔板上,打印針浸入探針溶液,吸取固定量的液體,移至支持物上方,然后打印針垂直運(yùn)動觸及支持物表面后留下液滴,隨后清洗打印針,干燥后進(jìn)行下一個位點(diǎn)的打印。也可用多針同時進(jìn)行打印。1718（二）樣品的制備19（二）樣品的制備樣品制備包括核酸分子的分離純化，擴(kuò)增，標(biāo)記。一般生物樣本不能直接用于芯片反應(yīng)，需要先進(jìn)行分離純化DNA或RNA，在通過PCR或者RT-PCR等方法擴(kuò)增待測分子，同時完成標(biāo)記。標(biāo)記有：熒光標(biāo)記，生物素標(biāo)記，放射性同位素標(biāo)記等。熒光標(biāo)記分辨率最高，最常用。20熒光標(biāo)記物FITC（異硫氰酸熒光素，fluoresceinisothiocyanate）Cy3和Cy5（菁類染料-Cyaninedyes）等21（三）分子雜交與雜交信號的檢測分析22（三）分子雜交與雜交信號的檢測分析1.分子雜交：DNA長度和類型、雜交目的檢測表達(dá)：高鹽、低溫、長時間檢測突變：低鹽、高溫、短時間高（嚴(yán)謹(jǐn)雜交）23優(yōu)化離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度（三）分子雜交與雜交信號的檢測分析2.雜交信號的檢測分析：熒光檢測激光共聚焦芯片掃描儀：基于光電倍增管(photomultipliertube,PMT)：靈敏度高、分辨率高、掃描時間長24（三）雜交與結(jié)果分析2.雜交信號的檢測：熒光檢測電荷耦聯(lián)裝置（charge-coupleddevices,CCD）芯片掃描儀：靈敏度低、分辨率低、掃描時間短25探針與樣品完全正常配對時所產(chǎn)生的熒光信號強(qiáng)度是具有單個或兩個錯配堿基探針的5-35