分子生物學(xué)實驗技術(shù)基因操作工具酶詳解演示文稿

分子生物學(xué)實驗技術(shù)基因操作工具酶詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有47頁\編輯于星期四優(yōu)選分子生物學(xué)實驗技術(shù)基因操作工具酶現(xiàn)在是2頁\一共有47頁\編輯于星期四酶酶限制性核酸內(nèi)切酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA連接酶末端轉(zhuǎn)移酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

S1核酸酶Klenow酶DNA酶Ⅰ

TaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶堿性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶現(xiàn)在是3頁\一共有47頁\編輯于星期四主要內(nèi)容1限制性核酸內(nèi)切酶2DNA連接酶3DNA聚合酶4修

飾

酶5小結(jié)現(xiàn)在是4頁\一共有47頁\編輯于星期四酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探針；2合成cDNA第二鏈；3填補雙鏈DNA3`凹端；4DNA測序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補平反應(yīng)，合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome現(xiàn)在是5頁\一共有47頁\編輯于星期四1限制性核酸內(nèi)切酶1.1引言1.2命名1.3分類1.4活性及影響因素Home現(xiàn)在是6頁\一共有47頁\編輯于星期四核酸酶（Nuclease）：通過切割相鄰兩個核苷酸殘基間磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈水解斷裂的蛋白酶。（1）按作用對象分:DNAase&RNAase（2）按斷裂核酸分子不同方式分：

Endonuclease&Exonuclease1.1引言—兩個概念現(xiàn)在是7頁\一共有47頁\編輯于星期四限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。限制酶與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationSystem)。Back現(xiàn)在是8頁\一共有47頁\編輯于星期四1.2命名命名原則：第一個字母（大寫,斜體）：該酶來源的微生物屬名；第二、三個字母（小寫、斜體）：微生物種名；若該微生物有不同的變種和品系，再加上該變種和品系的第一個字母（大寫）若從同一微生物發(fā)現(xiàn)多種限制性內(nèi)切酶，則依照發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。例如：EcoRⅠ從大腸桿菌R株分離的第一種限制酶命名為EcoRⅠ，其中E代表屬名（Escherichia)，co代表種名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表該菌株中首次分離到。Back現(xiàn)在是9頁\一共有47頁\編輯于星期四1.3分類1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶

Ⅱ型限制性內(nèi)切酶1.3.3Ⅲ

型限制性內(nèi)切酶Back現(xiàn)在是10頁\一共有47頁\編輯于星期四1.3.1Ⅰ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；識別位點和切割位點不一致，無固定切割位點；應(yīng)用：不常用。Back現(xiàn)在是11頁\一共有47頁\編輯于星期四1.3.2Ⅲ型限制性內(nèi)切酶功能：限制、修飾特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因子；特異切割，切割位點在距識別位點3`端24-26bp處。應(yīng)用：數(shù)量很少，無實際作用。Back現(xiàn)在是12頁\一共有47頁\編輯于星期四1.3.3Ⅱ型限制性內(nèi)切酶功能：識別并特異切割DNA分子。

即通常所指DNA限制性核酸內(nèi)切酶；反應(yīng)特點：僅需Mg2+作催化反應(yīng)輔助因子，能識別雙鏈DNA特殊序列，并可特異切割DNA，產(chǎn)生特異片段；應(yīng)用：種類繁多，分子克隆中最為常用現(xiàn)在是13頁\一共有47頁\編輯于星期四(1)基本特性識別長度為4-8個核苷酸的特異序列；許多識別序列具回文結(jié)構(gòu)，如HindⅢ的識別序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產(chǎn)生末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)現(xiàn)在是14頁\一共有47頁\編輯于星期四EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofRestrictionEndonucleases現(xiàn)在是15頁\一共有47頁\編輯于星期四(2)同功異源酶(isoschizomer)

來源不同但能識別和切割同一位點的酶。又稱同裂酶。如：BamHI(G↓GATCC)和BstI(G↓GATCC)注：有一些同功異源酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感度有所不同?，F(xiàn)在是16頁\一共有47頁\編輯于星期四(3)同尾酶（isocaudamer)

識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。如：BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCTBack現(xiàn)在是17頁\一共有47頁\編輯于星期四1.4

活性及影響因素(1)活性大?。好笇NA水解程度不同。(2)酶的活性單位：

指1μg純的指定DNA在指定緩沖液中，于37℃（最適溫度更準(zhǔn)確）酶解1h完全酶解DNA中所有同一限制性內(nèi)切酶位點所需的酶量?，F(xiàn)在是18頁\一共有47頁\編輯于星期四(3)影響因素①DNA模板的純度②DNA的甲基化程度③酶切反應(yīng)溫度④DNA的分子結(jié)構(gòu)⑤緩沖液Back現(xiàn)在是19頁\一共有47頁\編輯于星期四2DNA連接酶2.1定義及功能2.2種類及作用機理2.3使用時的注意事項Home現(xiàn)在是20頁\一共有47頁\編輯于星期四2.1定義及功能DNA連接酶（DNAligase）：可使一段DNA3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯鍵，把兩DNA片段連在一起封閉雙鏈上形成的切口的酶。現(xiàn)在是21頁\一共有47頁\編輯于星期四OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase連接缺刻(nick)Back現(xiàn)在是22頁\一共有47頁\編輯于星期四兩類:

◆T4DNA連接酶(ATP提供能量）

◆大腸桿菌DNA連接酶（NAD+提供能量）2.2種類及作用機理現(xiàn)在是23頁\一共有47頁\編輯于星期四T4DNAligase的作用機理Back現(xiàn)在是24頁\一共有47頁\編輯于星期四1)不能催化兩單鏈DNA分子連接；2)只能連雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；不能連接雙鏈中一個或多個核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3使用時的注意事項現(xiàn)在是25頁\一共有47頁\編輯于星期四DNAligase的活性Back現(xiàn)在是26頁\一共有47頁\編輯于星期四3DNA聚合酶（DNApolymerase）3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆轉(zhuǎn)錄酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶Home現(xiàn)在是27頁\一共有47頁\編輯于星期四3.1DNA聚合酶Ⅰ活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。發(fā)揮生物學(xué)活性的條件：（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3`-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對雙鏈DNA，當(dāng)有dNTP存在時，3`→5`降解活性會被5`→3`方向的聚合活性所抑制。應(yīng)用：缺口平移法制備DNA分子雜交探針現(xiàn)在是28頁\一共有47頁\編輯于星期四缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制備DNA分子探針Back現(xiàn)在是29頁\一共有47頁\編輯于星期四活性：

5`→3`聚合活性，3`→5`外切酶活性，無5`→3`外切酶活性。用途：（1）填補或標(biāo)記DNA的3`隱蔽末端；（2）催化合成cDNA第二鏈；（3）DNA序列測定3.2Klenow聚合酶現(xiàn)在是30頁\一共有47頁\編輯于星期四EcoRI酶切末端同位素標(biāo)記的EcoRI酶切末端α-32P-dATPBack現(xiàn)在是31頁\一共有47頁\編輯于星期四顯著特點：熱穩(wěn)定性。70℃反應(yīng)2h殘留活性90%；93℃反應(yīng)2h殘留活性60%；94℃反應(yīng)2h殘留活性40%。應(yīng)用：（1）對DNA的特定片段進行體外擴增；（2）DNA序列測定。3.3TaqDNA聚合酶Back現(xiàn)在是32頁\一共有47頁\編輯于星期四逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)：又稱RNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶?；钚裕?/p>

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是帶3`-OH的RNA或DNA。3.4逆轉(zhuǎn)錄酶現(xiàn)在是33頁\一共有47頁\編輯于星期四逆轉(zhuǎn)錄酶的活性現(xiàn)在是34頁\一共有47頁\編輯于星期四用途：（1）在體外以mRNA為模板合成cDNA；（2）對有5`突出末端的DNA片段作末端標(biāo)記（補平）；（3）雙脫氧法測序；（4）以DNA或RNA為模板合成核酸探針。Back現(xiàn)在是35頁\一共有47頁\編輯于星期四活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA強。

高濃度dNTP環(huán)竟下前者活性更強。應(yīng)用：標(biāo)記DNA平末端或隱蔽3`末端3.5T4DNA聚合酶Back現(xiàn)在是36頁\一共有47頁\編輯于星期四活性：5`→3`聚合酶活性；有單鏈及雙鏈的3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性；特點：極佳的連續(xù)合成能力應(yīng)用：（1）用于長模板DNA的引物延伸反應(yīng)；（2）通過單純延伸或取代合成途徑標(biāo)記DNA3`末端；（3）使雙鏈DNA5`或3`突出末端變平末端。3.6T7DNA聚合酶Back現(xiàn)在是37頁\一共有47頁\編輯于星期四4修飾酶4.1堿性磷酸酶4.2末端轉(zhuǎn)移酶4.3T4多核苷酸激酶4.4S1核酸酶

Home現(xiàn)在是38頁\一共有47頁\編輯于星期四4.1堿性磷酸酶功能：催化核酸脫5`-磷酸基團，使DNA或RNA片段5`-P末端轉(zhuǎn)換成5`-OH末端。來源：大腸桿菌：bacterialalkalinephosphatase(BAP);小牛腸道:calfintestinalalkalinephosphatase(CIP)。現(xiàn)在是39頁\一共有47頁\編輯于星期四堿性磷酸酶的活性現(xiàn)在是40頁\一共有47頁\編輯于星期四注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP卻是熱抗性酶。Back現(xiàn)在是41頁\一共有47頁\編輯于星期四來源:前淋巴細(xì)胞和分化早期的類淋巴細(xì)胞。功能：催化DNA進行5`→3`方向的聚合作用,逐個將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端。4.2末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)現(xiàn)在是42頁\一共有47頁\編輯于星期四末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用現(xiàn)在是43頁\一共有47頁\編輯于星期四用途：(1)(主要