色譜分析法引論優(yōu)秀公開課

第三章色譜分析法引論內(nèi)容提要：第一節(jié)色譜法概述第二節(jié)色譜法基本術(shù)語第三節(jié)

色譜法基本理論第一節(jié)色譜法概述一、色譜分析法的基本原理二、色譜分析法的分類三、色譜分離過程四、色譜法的特點其中裝填了填料的玻璃管稱為色譜柱；柱中的填料物質(zhì)稱為固定相；相對于固定相運(yùn)動、流經(jīng)固定相的空隙或表面的沖洗溶劑稱為流動相?，F(xiàn)在的色譜法早已不局限于色素的分離，其方法也早已得到了極大的發(fā)展，但其分離的原理仍然是一樣的。我們?nèi)匀唤兴V分析。2、色譜法的原理

色譜法也稱層析法，是一種將混合物樣品的各組分進(jìn)行分離，然后順序檢測各組分的分離與分析技術(shù)。色譜法是一種分離技術(shù)：試樣混合物的分離過程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運(yùn)動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)2、液相色譜法（LC）以液體為流動相的色譜法稱為液相色譜法。同理，按照固定相的狀態(tài)又可將液相色譜法分為：液-固色譜法：前者是以液體為流動相，以固體為固定相的色譜法。液-液色譜法：后者是以液體為流動相，以涂在載體表面的液體為固定相的色譜法。（二）按固定相的形式分類1、柱色譜：固定相裝在色譜柱中。液體或氣體流動相從柱頭向柱尾連續(xù)不斷地沖洗。共分為兩大類：填充柱色譜：固定相裝在一根玻璃或金屬管內(nèi)；毛細(xì)管柱色譜：固定相附著在一根細(xì)管內(nèi)壁上，管中心是空的，也叫開管柱色譜。上述對植物色素的分離即是經(jīng)典的填充柱色譜法。2、紙色譜：利用濾紙作載體，吸附在紙上的溶劑作固定相。液體流動相從薄層板一端向另一端擴(kuò)散。3、薄層色譜：將固體吸附劑在玻璃板或塑料板上制成薄層作固定相。液體流動相從薄層板一端向另一端擴(kuò)散。紙色譜和薄層色譜總稱平面色譜，平面色譜是靠濾紙或硅膠層的毛細(xì)管作用將流動相從一端吸上來，使樣品組分得以分離。3、離子交換色譜法：固定相為離子交換劑，利用離子交換劑與不同離子交換能力的不同，因而選擇性系數(shù)不同而進(jìn)行分離的色譜法。只有液相離子交換色譜。4、凝膠色譜法（尺寸排阻色譜法）：利用多孔性物質(zhì)作固定相，因其對不同大小分子的排阻作用不同，因而滲透系數(shù)不同而進(jìn)行分離的色譜法。只有液相凝膠色譜。5、電色譜法：利用帶電物質(zhì)在電場作用下移動速度不同進(jìn)行分離的色譜法。三、色譜分離過程

以分離A、B兩組分的氣-固吸附色譜為例：1、當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時，被固定相吸附；色譜分離過程2、隨著流動相的不斷流入，被吸附的組分又從固定相中脫附；3、脫附的組分隨著載氣向前移動時又再次被固定相吸附。4、隨著載氣的流動，吸附、脫附的過程反復(fù)地進(jìn)行。四、色譜法的特點色譜法是以其優(yōu)越的分離能力為特點，它的分離效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他分離技術(shù)如蒸餾、萃取、離心等方法。（1）分離效率高：復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體、手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高：可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個復(fù)雜試樣的分析。（4）樣品用量少：用極少的樣品就可以完成一次分離和測定。（5）應(yīng)用范圍廣：它幾乎可用于所有化合物的分離和測定，無論是有機(jī)物、無機(jī)物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以進(jìn)行分離和測定。氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。（6）操作簡便：分離和測定一次完成，可以和多種分析儀器聯(lián)用，易于自動化，可在工業(yè)流程中使用。不足之處：被分離組分的定性較為困難。第二節(jié)色譜法基本術(shù)語

一、色譜流出曲線試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，按先后次序經(jīng)過檢測器，檢測器將流動相中各組分濃度（或含量）的變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號，由記錄儀所記錄下信號-時間曲線或信號-流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，又稱色譜圖。二、色譜參數(shù)和術(shù)語1、基線當(dāng)沒有試樣組分而僅有流動相進(jìn)入色譜柱時，在實驗操作條件下，反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化的線稱為基線。穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條直線，所以基線的平直與否可反映出儀器及實驗條件的穩(wěn)定情況。圖中的OQ即為流出曲線的基線2、峰高(h)和峰面積(A)峰高是指色譜峰頂點到基線的垂直距離，以h表示。峰面積是指色譜峰曲線與峰底基線所圍成區(qū)域的面積，以A表示。意義：峰高或峰面積的大小和每個組分在樣品中的含量相關(guān)，因此色譜峰的峰高或峰面積是色譜法進(jìn)行定量分析的主要依據(jù)。3、保留值保留值表示試樣中各組分在色譜柱中的滯留時間，通常用時間（也可用將組分帶出色譜柱所需載氣的體積）來表示。

在一定的實驗條件下，任何一種物質(zhì)都有一定的保留值。保留值是色譜定性分析的依據(jù)。②保留時間（tR）：試樣中某組分的保留時間指從進(jìn)樣到出現(xiàn)其色譜峰極大值時的時間。它包括組分隨流動相通過柱子的時間tM和組分在固定相中滯留的時間t’R。tR可作為色譜鋒位置的標(biāo)志。③調(diào)整保留時間（t’R）：

扣除了死時間的保留時間，即組分在固定相上滯留的時間。

t’R=tR-tM

t’R反映了被分析的組分因與色譜柱中固定相發(fā)生相互作用，而在色譜柱中滯留的時間，它更確切地表達(dá)了被分析組分的保留特性，因而是色譜定性分析的基本參數(shù)。4、色譜峰的區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學(xué)因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法：

標(biāo)準(zhǔn)偏差σ半峰寬W1/2峰底寬Wb標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：峰高0.607倍處峰寬的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354σ。峰底寬Wb：色譜峰兩側(cè)拐點上切線與基線的交點間的距離。Wb=4σ。峰拐點：在組分流出曲線上二階導(dǎo)數(shù)等于零的點，稱為峰拐點，如圖中的E點與F點。5、分配系數(shù)如前所述，色譜分離的實質(zhì)是基于樣品組分在固定相和流動相之間反復(fù)多次的分配平衡。這種分離過程經(jīng)常用樣品組分的分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)(K)，即在一定溫度下，組分在兩相之間分配達(dá)到平衡時的濃度比。

當(dāng)K=1時，組分在固定相和流動相中濃度相等。當(dāng)K>1時，組分在固定相中的濃度大于在流動相中的濃度。當(dāng)K<1時，組分在固定相中的濃度小于在流動相中的濃度。意義：分配系數(shù)是色譜分離的基本參數(shù)之一，實際工作中常應(yīng)用分配系數(shù)K來表征色譜分配過程。色譜柱中不同組分能夠分離的先決條件是其分配系數(shù)不同。分配系數(shù)小的組分，在固定相中停留時間短，較早流出色譜柱；分配系數(shù)大的組分，在流動相中的濃度較小，移動速度慢，在柱中停留時間長，較遲流出色譜柱；兩組分分配系數(shù)相差越大，兩峰分離得就越好。分配系數(shù)K是由組分的性質(zhì)及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，隨柱溫及柱壓變化，與柱中兩相的體積無關(guān)。6、分離度同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標(biāo)，也稱總分離效能指標(biāo)或分辨率。定義為：相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩個組分色譜峰峰底寬度總和之半的比值。

式中，R=0.8，兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1.0，分離程度達(dá)98%；

R=1.5，分離程度達(dá)99.7%，是相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)。討論：色譜分離中的四種情況的討論：柱效、分配系數(shù)與分離效果的關(guān)系：①柱效較高，△K(分配系數(shù)差)較大，完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大，但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。小結(jié)：色譜流出曲線的意義色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)；色譜保留值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾取V柱分離效能評價指標(biāo)；色譜峰間距——固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。第三節(jié)色譜法基本理論一、塔板理論二、速率理論色譜理論

色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；

塔板理論的假設(shè)：（1）在每一個平衡過程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；（2）將流動相看作成脈動（間歇）過程；（3）試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；（4）每次分配的分配系數(shù)相同。一、塔板理論-柱分離效能指標(biāo)

1.塔板理論（platetheory）半經(jīng)驗理論：將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)（類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程）；

色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為（經(jīng)驗公式）：保留時間包含死時間，在死時間內(nèi)不參與分配!2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計算可得到不同的理論塔板數(shù)。

組分在tM時間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：3.塔板理論的特點和不足特點:（1）當(dāng)色譜柱長度一定時，塔板數(shù)n越大(塔板高度H越小)，被測組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。（2）不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)。不足:（1）柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。（2）塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。二、速率理論-影響柱效的因素速率理論是在繼承塔板理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。它闡明了影響色譜峰變寬的物理化學(xué)因素，并指明了提高和改進(jìn)色譜柱效能的方向，對毛細(xì)管柱色譜和高效液相色譜的發(fā)展起著指導(dǎo)性的作用。該理論用速率理論方程式（范特姆特方程式）闡明影響理論塔板高度即柱效能的因素。1、速率方程（也稱范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)上式表明：①減小A、B、C三項可提高柱效；②存在著最佳流速。

A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？A─渦流擴(kuò)散項

由于組分分子與柱內(nèi)填充顆粒發(fā)生碰撞，形成流動相紊流，引起譜峰變寬，使柱效降低。

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子B/u—分子擴(kuò)散項

由于柱內(nèi)存在著濃度梯度，組分分子由高濃度處向低濃度處擴(kuò)散，方向與流動相運(yùn)動方向一致，從而使譜峰擴(kuò)張，H↑(n↓)，分離變差。

分子擴(kuò)散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴(kuò)散↑;與流動相的摩爾質(zhì)量有關(guān)，M載氣↑，擴(kuò)散↓。因此，加快流動相的流速、使用摩爾質(zhì)量大的流動相，可以減少分子擴(kuò)散。C·u—傳質(zhì)阻力項兩相間的傳質(zhì)阻力使柱橫斷上的濃度分配不均勻，引起峰擴(kuò)張。改善兩相間傳質(zhì)可削弱傳質(zhì)阻力的影響。減小擔(dān)體粒度，選擇小