動物細胞工程1課件

動物細胞工程動物細胞工程常用的技術(shù)手段：動物細胞培養(yǎng)、動物細胞核移植、動物細胞融合、單克隆抗體動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。提問：植物細胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng),植物體細胞雜交一動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。思考：動物細胞培養(yǎng)的過程是怎樣的呢？閱讀思考：為什么細胞培養(yǎng)要分散成單個細胞培養(yǎng)？怎樣分散？用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要成分是什么？用胃蛋白酶行嗎？3什么是細胞貼壁和細胞接觸抑制？什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)的細胞具有什么特點？為什么細胞培養(yǎng)要分散成單個細胞培養(yǎng)？怎樣分散？1.成塊的組織中細胞與細胞靠在一起，彼此限制了細胞的生長和增值。2.從健康動物體內(nèi)取出組織塊，剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要成分是什么？用胃蛋白酶行嗎？1.在進行動物細胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。2.動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。動物細胞生長特性：細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。要求：

培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。細胞的接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。

什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？傳代培養(yǎng)的細胞具有什么特點？原代培養(yǎng)：將動物組織用胰蛋白酶處理成單個細胞，配制成一定濃度的懸浮液，放入培養(yǎng)瓶中在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的過程傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)瓶中的細胞越來越多，用胰蛋白酶處理使細胞從瓶壁上脫離下來，配制成懸浮液，分瓶培養(yǎng)的過程動物細胞培養(yǎng)過程胚胎或幼齡動物的組織器官細胞懸液10代細胞50代細胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。比老齡動物的組織細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越強，越容易培養(yǎng)。動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細胞增殖緩慢，核型可能變化動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。貼壁生長接觸抑制10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型傳代培養(yǎng)細胞系討論：多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境知識，思考并討論以下問題：1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物資？2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境件？充足的營養(yǎng)(葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、促生長因子和動物血清等。)氣體無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度和PH動物細胞培養(yǎng)條件：1、無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）3、溫度和PH

36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、氣體環(huán)境：O2和CO2（95%空氣和5%CO2）保證細胞順利的生長增殖動物細胞培養(yǎng)液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。與植物培養(yǎng)基相比其特點是：（1）液體培養(yǎng)基（2）含有動物血清動物體細胞大都生活在液體的環(huán)境1、在動物細胞培養(yǎng)過程中，下列哪種現(xiàn)象是不可能的（）A．細胞一直在細胞懸液中分裂生長B．有少部分細胞可能在培養(yǎng)條件下無限地傳代下去C．有部分細胞核型會發(fā)生變化D.個別細胞會發(fā)生基因突變2、下列過程與細胞培養(yǎng)無關(guān)的是------------------（）A.檢測有毒物質(zhì)B.生產(chǎn)單克隆抗體C.篩選抗癌藥物D.雜交育種

AD練習：強調(diào)一：細胞貼壁過程■細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。■培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附?！霎斮N壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。強調(diào)二：接觸抑制

我們能否用植物組織培養(yǎng)的方法使動物細胞發(fā)育成動物個體？

根據(jù)動物細胞核仍具有全能性的特點,怎樣將動物細胞的全能性表達；把兩種動物的優(yōu)良性狀集合在一塊兒?思考：二動物體細胞核移植技術(shù)

和克隆動物動物體細胞核移植技術(shù):將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植（難度高）

◆取供體細胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？過程供體細胞（供核）細胞培養(yǎng)體細胞卵母細胞（減２中期：供質(zhì)）去核無核卵母細胞注入電刺激重組細胞重組胚胎胚胎移植代孕母體新個體(與母體相同的個體)3.你認為用上述體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體DNA是來自于受體卵母細胞。此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的一些行為、習性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復(fù)制。應(yīng)用前景1、加快家畜遺傳改良進程2、保護頻危物種3、器官移植供體4、利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物蛋白前景應(yīng)用前景1、加快家畜遺傳改良進程2、保護頻危物種3、器官移植供體4、利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物蛋白存在問題成功率低存在健康問題克隆動物食品的安全問題許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。小結(jié)：動物體細胞核移植技術(shù)

和克隆動物過程應(yīng)用前景存在問題

動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)過程培養(yǎng)條件應(yīng)用動物細胞融合與1、定義：指用自然或人工方法使兩個或多個不同的動物細胞融合成一個細胞的過程。一、動物細胞融合

2.結(jié)果：形成了單核的雜交細胞3.原理：細胞膜的流性4、誘導(dǎo)方式：物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒

細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合

受精作用

把兩個不同的動物細胞放在一起，用滅活的病毒處理細胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進而形成雜交細胞。

融合后的雜交細胞經(jīng)過有絲分裂后仍能形成兩個完整的雜交細胞動物細胞融合的過程

思考討論：為什么細胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？

因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細胞，而不能誘導(dǎo)細胞融合。3、動物細胞融合技術(shù)的應(yīng)用細胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。利用細胞融合技術(shù)，制備單克隆抗體。人們獲得抗體的傳統(tǒng)方運用法是?將抗原注入動物體,然后從動物血清中提取抗體這種方法的缺點是什么?產(chǎn)量有限，純度低，特異性差，反應(yīng)不夠靈敏運用已學(xué)知識，設(shè)想怎樣獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體？

每一個B淋巴細胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強的抗體如果利用單個B淋巴細胞進行無性繁殖（克隆），形成細胞群，這樣的細胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體——單克隆抗體。能否用單個B淋巴細胞通過克隆形成的細胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B淋巴細胞在體外不能無限增殖。二：動物細胞融合的成功應(yīng)用

——單克隆抗體的制備思考怎樣解決這一問題呢？什么樣的細胞能夠在體外無限增殖呢？單克隆抗體的制備---極富創(chuàng)造性的方案如果把一種B淋巴細胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞進行融合，所得到的融合細胞既能大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體

米爾斯坦(阿根廷)和科勒(德國)因此在1984年獲諾貝爾獎。B淋巴細胞注射特定抗原蛋白骨髓瘤細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞融合培養(yǎng)液中細胞有幾種類型？（只考慮兩兩融合）融合細胞幾種類型？5種B淋巴細胞、骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞---骨髓瘤細胞B淋巴細胞---B淋巴細胞B淋巴細胞---骨髓瘤細胞3種骨髓瘤細胞---骨髓瘤細胞B淋巴細胞---B淋巴細胞B淋巴細胞---骨髓瘤細胞多種雜交細胞在具有篩選作用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)專一抗體檢驗陽性克隆上述雜交細胞分開不同雜交細胞，克隆專一抗體，檢驗陽性細胞單克隆抗體注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)1、單克隆抗體的制備過程第1次篩選目的：得到雜交瘤細胞（多種）。第2次篩選目的：在雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞。該細胞繼承雙親細胞的遺傳特性，既能產(chǎn)生專一抗體又能無限增殖。雜交瘤細胞有何特點？特異性強，靈敏度高雜交細胞滅活的病毒等手段小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞經(jīng)免疫的小鼠提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選能產(chǎn)生特定抗體、培養(yǎng)條件下能無限增殖的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔提取單克隆抗體1.單克隆抗體的制備過程：特點：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖單克隆抗體制備過程B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導(dǎo)融合B-B細胞B-瘤細胞瘤-瘤細胞選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞（B-瘤細胞）克隆化培養(yǎng)抗體檢測產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體課堂小結(jié)單克隆抗體制備過程中應(yīng)用哪些細胞工程技術(shù)手段？動物細胞融合技術(shù)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)B淋巴細胞骨髓瘤細胞特點：特異性強靈敏度高可大量制備1、作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準確、高效、簡易、快速特點.2、用于治療疾病和運載藥物：主要用于癌癥治療。生物導(dǎo)彈：抗癌細胞的單克隆抗體+放射性同位素+化學(xué)藥物或細胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準確找到癌細胞位置，原位殺死癌細胞。）2、單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，可大量制備。3、單克隆抗體的應(yīng)用項目動物細胞融合植物體細胞雜交原理細胞膜的流動性細胞膜的流動性和植物細胞的全能性融合前提分散成單個細胞去除細胞壁誘導(dǎo)方法聚乙二醇、離心、振動、電激、滅活病毒聚乙二醇、離心、振動、電激、結(jié)果獲得雜種細胞或細胞產(chǎn)物獲得雜種植株用途制備單克隆抗體培育作物新品種意義使遠緣雜交成為可能克服遠緣雜交障礙B體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞足夠數(shù)量的細胞群注射到小鼠腹腔AC

下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風桿菌單克隆抗體的實驗方案2、