質(zhì)粒的酶切-瓊脂糖凝膠電泳分離DNA課件_第1頁
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文檔簡介

實驗二質(zhì)粒的酶切、瓊脂糖凝

膠電泳分離DNA

實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒瀮x器、材料與試劑實驗步驟實驗結(jié)果及討論

實驗?zāi)康南拗菩詢?nèi)切酶切割出目的DNA了解瓊脂糖凝膠電泳的原理掌握瓊脂糖凝膠的制作及進行電泳的方法pBCSKmap它的原理是溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負極向正極泳動時，溴化乙錠從正極向負極移動，這樣溴化乙錠分子就會嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測DNA的濃度。（二）材料實驗一中提取的質(zhì)粒DNA和酶切后的質(zhì)粒DNA。（三）試劑

1.限制性內(nèi)切酶EcoRI，2.TAE電泳緩沖液(50×)（pH8.0）

Tris242g

冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml3.溴化乙錠溶液10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑紙包裝保存。4.10×DNA樣品上樣緩沖液5.瓊脂糖瓊脂糖凝膠制備1.洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。2.插好擋板、梳子。3.根據(jù)實驗所需稱取0.4克瓊脂糖，放入制膠的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml電泳緩沖液（1×TAE）。4.加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解。5.溶液冷至約60℃時，加入溴化乙錠4μL(終濃度為0.1g/l)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無氣泡。6.室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。7.加入電泳緩沖液（1×TAE）至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。

8.在DNA樣品中加入2μL(1/10體積)的10×DNA上樣緩沖液(loadingbuffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。9.用移液器吸起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。實驗結(jié)果及討論質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中一般為三條帶，最前面的條帶為超螺旋構(gòu)型，中間為線型，最后為單鏈有缺刻的構(gòu)型。如提取過程中有機械損傷，可能在膠上出現(xiàn)彌散。影響RE(限制性內(nèi)切酶)活性的主要因素：DNA的純度；DNA的甲基化程度；溫度；緩沖液成分（DDT，BSA）等。使用3mg的DNAMarkerDL

2,000（500ng/條帶）進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后

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