各種培養(yǎng)液的配方

各種溶液的配制基礎(chǔ)公式最終摩爾濃度=最初摩爾濃度/稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)=稀釋后液體總量/需稀釋液體量。最初摩爾濃度X需稀釋液體量最終摩爾濃度=稀釋后液體總量例如，需稀釋液體量0.1ml,濃度為1mmol/L,最終稀釋總量4ml,最終的濃度0.025mmol/L以配1000ml液體為例，g=分子量*摩爾濃度(M)(或mmol/1000)配50ml0.1mmol/LCaCl2為例g=147*0.5/1000/20(1000/50) 0.003675g0.3mol/L甘露醇 g=182.2*0.3/20(1000/50) 2.733g或X=分子量X摩爾濃度(mol/L)/ (1000/需要量)X=分子量X摩爾濃度(mmol/L)/1000/(1000/需要量)各種濃縮液的配制FSH濃縮液FSH（中科院）規(guī)格10mg/瓶，用10ml水稀釋，即lmg/ml。分裝規(guī)格：250^1/管（即濃縮液）,配50ml0M液時(shí)，加入濃縮液1管，即5ug/m1oLH濃縮液LH（寧波）規(guī)格200IU/管，用2ml水稀釋，分裝成8管。分裝規(guī)格：25IU/管（即濃縮液）配50ml0M液時(shí)，加入濃縮液2管，即0.5IU/m1o17B-E2濃縮液2E22.5mg溶于100卩l(xiāng)乙醇，然后用25ml水稀釋，分裝成25管,分裝規(guī)格：100卩g/ml/管（濃縮液）臨用前，再分裝成500ul/管，配50ml0M液時(shí)，加入濃縮液1管。HMG濃縮液HMG（），含有FSH/LH75IU。用10ml無離子水稀釋。7.5IU/ml/管（即濃縮液）。如配100ml0M時(shí)加入1管(1ml),即終濃度0.075IU/ml。Ca、Mg離子濃縮液PBS(200ml)用Ca、Mg離子濃縮液100ml：稱取CaC|.2H2O2.64g(100X)、MgC^.6H2O2g(100X)，溶于100ml水中，0.0264g+0.02g/mlCaCl2.2H20/MgCl2.6H20(濃縮液)。分裝規(guī)格：1ml/管。 2 2PBS(200ml)用Ca、Mg離子濃縮液25ml：稱取CaC^.2H2O0.66g(100X)、MgC^.6H2O0.5g(100X)，溶于25ml水中，0.0264g+0.02g/mlCaCl2.2H20/MgCI.6H20(濃縮液)。分裝規(guī)格：1ml/管。配200mlPBS時(shí)，加入濃縮液1管。SoF(50ml)用Ca、Mg離子濃縮液100ml：稱取CaC^.2H2O1.26g(100X)、MgC^.6H2O0.5g管。(100X),溶于(100X),溶于100ml水中,0.0126g+0.005g/mlCaC^.2H2O/MgCI.6H2O（濃縮液）。分裝規(guī)格：1ml/SoF(50ml)用Ca、Mg離子濃縮液25ml：稱取CaC^.2H2O0.315g(100X).MgC^.6H2O0.125g(100X)，溶于25ml水中，0.0126g+0.005g/mlCaCI.2H2O/MgC^.6H2O(濃縮液)。分裝規(guī)格：1ml/管。配50mlSoF液時(shí)，加入濃縮液1管。配100mlSoF液時(shí)，加入濃縮液2管200mMGlutamine(100X)濃縮液Glutamine2.922g溶于100ml水中。0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA?4Na混合消化液0.05%胰蛋白酶 0.5gEDTA?4Na 0.2gPBS（無Ca2+，Mg2+）加1L（1000ml）,過濾除菌，分裝小瓶,2-5ml/瓶,-20°C保存。0.25%胰蛋白酶一0.004%EDTA混合消化液稱取胰蛋白酶粉末0.5g（1：250）和EDTA0.08g，先用少量PBS（無Ca2+，Mg2+）中，常溫?cái)嚢?，徹底溶解，然后在補(bǔ)足PBS（無Ca2+,Mg2+）加至200ml，用0.22um濾膜過濾分裝,-20C保存（一次用完不宜反復(fù)凍溶）0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液

0.25g0.02g胰蛋白酶(Trypsin)粉 (1：250)0.25g0.02gEDTA粉0.01mol／LPBS100ml先用少量PBS(無Ca2+,Mg2+)溶解胰蛋白酶，然后將EDTA粉末和剩下的液體加入混合，置37°C水浴中1小時(shí)左右(待徹底溶解，液體呈透明為止)，用G抽濾，分裝置4°C冰箱中保存。510．A23187(IA)1mmol/L濃縮液：取1mgIA用1.9mlDMS0或DMS0/乙醇混合液溶解為1mmol/L濃縮液。應(yīng)用時(shí)，用純凈水或培養(yǎng)液(無BSA)稀釋后使用。TCM-199+15mmol/LHepes+0.168mg/mlNaHCO3+5umol/LA23187信息IA激活用無Ca2+培養(yǎng)液，獲得更多的卵母細(xì)胞激活。11.6-DMAP(2mM)取0.0326g6-D溶于500ulDMSO中，即為濃縮液，濃縮液再分裝成50ul凍存。需要時(shí)50ul6-D濃縮液中加入10mlSoF液，再分裝成400ul,即工作液。Ion(5uM)用DMS0溶解(2mg/ml),18.7ulIonomycin,加入到10mlSoF液，再分裝成400ul,即工作液。0.1%透明質(zhì)酸酶用PBS(無Ca2+Mg2+)配制。30mlPBS，加入0.03gHy。13.CCB50ulCB，加入20mlPBS,即操作液。14.1MMgSO4Stock24.074gMgSO4，distilledwaterto200ml，storeatroomtemperature.1MHEPES,pH=7.0Stock119.15gHEPES(freeacid)，distilledwaterto400ml，addsolidNaOHafewpelletsatatimewhilemixinguntilthepHis~6.8，addconcentratedNaOHdropwisetoachievepH=7.0，distilledwaterto500ml，sterilefilterandstoreat4oC.0.5MEDTAStock16.81gEDTA(SodiumSalt)，distilledwaterto90ml，AdjustpHto7.0，Distilledwater100mlStoreatroomtemperature.10MNaOHStock40gNaOH,distilledwaterto100ml,storeatroomtemperature._0.05MCaCI2(per200ml),CaCI2?2H2O1.5g,Add198mlwater.Autoclave._0.5MCaCI2(per200ml),CaCI2?2H2O 15.0g,Add188mlwater.Autoclave._0.1MMgSO4(per200ml),MgSO4(anhydrous)2.4g,Add200mlwater.Autoclave.40%Glucose(per200ml),Glucose(dextrose)80.0g,Addwaterto200ml(~145-150ml).Autoclave.2%Gelatin(per500ml)Gelatin 10g,Add500mlwater.Autoclave.10mMEDTAForexample,for10mMEDTA,multiply292.24X0.010toobtain2.92gramsofEDTAperliterCa卄/Mg卄freePhosphatebufferedsaline-10X(10XPBSA)Dissolve80gramsofNaCl,2.0gramsofKCl,15.0gramsofDibasicsodiumphosphateand2.0gramsofMonobasicpotassiumphosphate(K2POMW136.09)in1literofdistilledwater.Thismakesa10XsolutionofCa^/Mg卄freephosphatebufferedsaline.Dilute1:10priortouse.Storeinarefrigerator.Sodiumbicarbonate(NaHCOMW84.0)0.1MDissolve0.84gramsofNaHCOtoafinalvolumeof100mlwithwaterorbuffer1mol/LMgC12:溶解20.3gMgCl2?6H20于足量的水中，定容到100ml。27.100mmol/LPMSF溶解174mg的PMSF(苯甲基磺酰氟)于足量的異丙醇中，定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹或貯存于-20°C?？敲顾?kanamycin)(10mg/ml)溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20C貯存。常以10ug/ml?50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。氯霉素(chloramphenicol)(25mg/ml)溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20C貯存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。

鏈霉素（streptomycin）（50mg/ml）溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20°C貯存。常以10ug/m1?50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。5.6%NaHC03溶液稱NaHC035.6克，溶于100ml蒸餾水中，室溫保存即可（如需要也可10磅15分鐘高壓滅菌,4C冰箱保存）32.VE濃縮液（100X）1mlVE用50ul0.05%酒精溶解。取液1ml,再加0M液99ml，其終濃度為100umol/L。Hanks液原液甲160g8g160g8g2g2g2.8g再加2ml氯仿防腐，置4C冰箱備用。KClMgSO?7H042MgCI?6H022溶于800ml餾水中。CaCl?（無水）溶于100ml蒸餾水中。將兩種液體混合后，加水至1000ml用濾紙濾過,原液乙3.04g1.2g20.0g然后加3.04g1.2g20.0g然后加0.5%酚紅80ml，再加水至1000ml，最后加入22 4 2KHP024葡萄糖溶于800ml蒸餾水中，用濾紙過濾,ml氯仿防腐，置4C冰箱備用。使用液甲乙兩液各1份，雙蒸水18份，混勻分裝包扎好瓶口，經(jīng)10磅15分鐘高壓滅菌后置4C冰箱中保存。使用時(shí)用5.6%NaHC03調(diào)pH值到所需要求。1640培養(yǎng)液（含10%小牛血清）10.39gRPMI-1640粉

10.39g雙蒸水加至雙蒸水加至1000ml通入適量的C02氣體，邊通入CO2邊慢慢攪拌，使其（呈透明）完全溶解。用NaHCOJ.5克調(diào)pH值到7.2。TOC\o"1-5"\h\z雙抗1萬u/ml 10ml滅活小牛血清 110ml混勻上述液體，立即用G抽濾除菌分裝，置4°C冰箱備用。635．青、鏈霉素溶液青霉素鈉鹽（40萬u/瓶） 5瓶鏈霉素（100萬u/瓶） 2瓶將兩者溶于200ml0.9%的無菌生理鹽水，分裝小瓶，-30C保存。雙抗在培養(yǎng)基中的終濃度為各lOOu為宜。36．1MNaOHStockNaOHdistilledwaterto50ml,storeatroomtemperature.37．上皮細(xì)胞培養(yǎng)體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細(xì)胞生長。以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞，其法如下（黑木凳志夫1981）1、 取材：取皮膚小塊，切成0.5－1平方厘米小塊。2、 置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。3、 換入0.25%胰蛋白酶中，4C過夜。4、 分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。5、 取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37C，30—60分鐘。6、 反復(fù)吹打，制成懸液。7、 培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。8、 直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。38．顆粒細(xì)胞單層的制備IVM26h卵母細(xì)胞經(jīng)透明質(zhì)酸酶消化處理后將卵母細(xì)胞移出將酶液及顆粒細(xì)胞用IVC液離心（1500rpm,5min）漂洗3次用移卵針吸取少量顆粒細(xì)胞置于培養(yǎng)液滴中5%CO238.6飽和濕度培養(yǎng)48h,以顆粒細(xì)胞貼壁生長過半者為宜半換液備用39．輸卵管上皮細(xì)胞單層的制備選有紅體或新鮮黃體的卵巢無菌條件下輕輕刮取輸卵管內(nèi)表面少量黏膜IVC培養(yǎng)液離心1500rpm5min,洗滌3次用移卵針吸取少量輸卵管上皮置于培養(yǎng)液滴中5%CO238.6飽和濕度培養(yǎng)48h，可見有輸卵管上皮貼壁生長并且有大量輸卵管上皮細(xì)胞在液滴中懸浮生長600x倒置顯微鏡下觀察可見上皮表面大量纖毛鮮活地?cái)[動(dòng)半換液備用40.mSOF+SLG共培養(yǎng)孤雌激活卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)用IVC液將激活的卵母細(xì)胞洗滌三次移入IVC培養(yǎng)盤15?20個(gè)/滴5%CO238.6,飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)每48h半換液一次48h觀察卵裂情況并計(jì)算卵裂率7?10天觀察囊胚,計(jì)算囊胚率。將提前48h制備的輸卵管上皮細(xì)胞單層用mSOF培養(yǎng)液半換液，并將需要共培養(yǎng)。二細(xì)胞以上的胚胎用培養(yǎng)液漂洗三次后移入單層培養(yǎng)液滴進(jìn)行培養(yǎng)每48h半換液一次并觀察發(fā)育情況TCM199+KL+mSOF+SLG共培養(yǎng)將卵裂的胚胎先置于TCM199+KL共培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)育至8細(xì)胞時(shí)，將其移入mSOF+SLG共培養(yǎng)系統(tǒng)中，每48h半換液一次并觀察發(fā)育情況。細(xì)胞原代培養(yǎng)原理將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。儀器、材料及試劑儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37°C）,培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37C）材料：胎鼠或新生鼠試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank's液，碘酒操作步驟胰酶消化法1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。2、 用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（lmm2）,再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、 視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37°C中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。5、 加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6、 靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。7、 1000rpm,離心10分鐘，棄上清液。8、 加入Hank's液5ml,沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。9、 加入培養(yǎng)液l—2ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。10、 將細(xì)胞調(diào)整到5X105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37C下培養(yǎng)。上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質(zhì)酶等）。組織塊直接培養(yǎng)法自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37C靜置3—5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37C繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項(xiàng)1、 自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。2、 在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3、 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。無菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng)1、 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。4、 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。5、 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。6、 吸溶液的吸管等不能混用。1MNaOH溶液配25ml1MNaOH溶液的配制：稱取NaOHlg,溶于25ml三蒸水中，即為IMNaOH，用于調(diào)節(jié)溶液的PH值。1MHCI溶液配25ml1MHCI溶液的配制：X=分子量X摩爾濃度（mol/L）X需要量/1000

X=37.5X1M/LX25ml/1000mlX=0.937543.1.5molHepesHepes36.0g,NaOH3.3g,加水至100ml。44.2ug/mlEGF母液（曹鴻國）100ugEGF加入50ml（可根據(jù)需要量）純凈水，先向EGF管中加入0.5ml水，吸出加入50ml水中，再從50ml水中吸0.5ml水，如此反復(fù)多次，然后分裝，即為2ug/ml母液。1ml（1管）EGF加入100ml溶液中，其濃度為20ng/ml。1ml（1管）EGF加入50ml溶液中，其濃度為40ng/ml。5ug/mlEGF母液（李向臣）稱取BSA0.0195g充分溶于20m1超純水中，然后再加入0.142g醋酸（lOinino1）溶解后，向100ugEGF管中加入0.5ml水，吸出加入20ml水中，再從20ml水中吸0.5ml水，如此反復(fù)多次，然后分裝，即為5ug/ml母液。200ul（1管）EGF加入100ml溶液中，其濃度為10ng/ml。400ul（1管）EGF加入100ml溶液中，其濃度為20ng/ml。45.0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶粉末（1：250） 0.25gPBS（無Ca2+,Mg2+） 100ml先用少量PBS（無Ca2+，Mg2+）中，常溫?cái)嚢?，徹底溶解，液體呈透明為止，然后在補(bǔ)足3BS（無Ca2+，Mg2+）加至100ml，用0.22um濾膜過濾分裝,-20°C保存（一次用完不宜反復(fù)凍溶）（一次用不完可在置4°C冰箱中保存）。46.體外活體染色觀察和活體染料堿性活性染料（帶正電荷）噻嗪類（次甲基藍(lán)、甲苯胎藍(lán)）丫嗪類（中性紅、詹納斯綠）惡嗪類（亮焦油藍(lán)、亮焦油柴）三酚苯甲烷類（甲基柴、維克多利亞藍(lán)）工作液：用PBS、生理鹽水配制，配0.1%-0.03%的濃度。47.孕酮（10umol/L）4°C冰箱中保存第一儲(chǔ)存液孕酮無水乙醇孕酮無水乙醇3.145mg10ml第二儲(chǔ)存液第一儲(chǔ)存液Hank，第一儲(chǔ)存液Hank，sBSS0.05ml4.95ml凍存液DMEM6mlDMSO1.5ml血清2.5mlTE液（100ml）0.15%:T150mg（0.15g）0.02%:EDTA20mg（0.02g）加水至100ml。蛋白酶K濃縮液蛋白酶K5mg/250ml20mg/ml分裝小管，0.4ml消化緩沖液中加250卩l(xiāng)蛋白酶。蛋白酶K1mg/ml濃度消化細(xì)胞，預(yù)計(jì)消化5小時(shí)。51.消化緩沖液（10ml）PH：8.0NaCI100mmol/L0.059gTirs10mmol/L10ml/Tirs.HEDTA25mmol/L0.0867g0.1mg/ml蛋白酶K1mg/10mlSDS0.05g52.DMBA0.2mgDMBA加入20ml培養(yǎng)液，濃度為10卩g/ml。53．各試劑溶解性質(zhì)成分名稱溶劑貯存液的濃度°C工作濃度胰島素0.01mol/LHCL2.5mg/mL40.1-10ug/mL三碘甲腺原AA（Ts）0.02mol/LNaoH5*10-7mol/L-201-100pmol/L氫化可的松95%酒精1*10-5mol/L41*10-7mol/L雌激素?zé)o水乙醇100umol/L41-10nmol/LEGFH2O2ug/mL-20C1-100ng/mlIGFH2O2ug/mL-20C1-100ng/mlVCH2O1mg/mL410ug/mLVE丙酮1mg/mL410ug/mLVA無水乙醇5ug/mL-20C避光50ng/ml丁二胺Hank，s50mmol/L410umol/L亞油酸無水乙醇10-3mol/L-20C10-5mol/L去脂牛血清白蛋白DMEM/F1210-3mol/L-20C10-5mol/L成份：g/100mlNaCI0.8000KCI0.0203NaHPO42KHPO42Na-Py0.11520.02030.0036Glucose0.1BSA0.2CaCI.2H2O2MgCI.2H2OS/N0.01340.010.005Phenolred少許PH：配法：注意：CacL2.2H20和MgCI2?2H20單獨(dú)溶解后緩慢倒入。g/100mlg/100ml0.800.0200.1150.0200.00360.10.0010.01320.010.005little2%成份：NaCIKCINaHPO42KHPO42Na-PyGlucoseHeperinCaCI.2H2O2MgCI.6H2OS/NPhenolredNCSPH:配法：注意： 1.CacL2.2H20和MgCI2?6H20單獨(dú)溶解后緩慢倒入。2.定量（如100ml）后棄2.0ml無離子水。評(píng)價(jià)：PBS(無Ca2+Mg2+)成份：g/100mlNaCI0.8000KCINaHP04(無水)2KHPO420.0200.1150.020PH:配法注意:l.NaHPO4?7H2O20.216g2.加不加下列成份?Na-PyGlucose0.00360.1S/NPhenolred0.005少許NCS2%評(píng)價(jià):57M199基礎(chǔ)液配方T成份：g/100mlTCM1990.95NaHCO30.22Hepes0.2384Na-Py0.022Pencillin0.0075Strepotomycin0.005PH:58OM（綿羊用）配方T成份：g/l00mlTCM1990.95NaHCO30.22Hepes0.2384Na-Py0.022Glutamine0.003FSH(5ug/ml)2管LH(0.5IU/ml)4管17B-E(lug/ml)21ml（分裝）S/N0.005Phenolred少許FBSl0mlPH:配法：注意:此配方是目前使用的OM液配方。李雪鋒的OM液配方中Na-Py的濃度0.0042g/100ml。評(píng)價(jià):

59OM（綿羊用） 配方一2成份：g/l00mlTCM1990.95NaHCO3HepesNa-PyGlutamine0.220.23840.0220.003HMG(0.075IU/ml)17B-E(lug/ml)2S/N1ml（分裝）1ml（分裝）0.005Phenolred少許FBS10mlPH:配法注意:評(píng)價(jià):成份：g/100mlg/50mlNaCI0.62940.3147KCI0.05340.0267KH2PO40.01620.0081NaHCO30.21060.1053Na-Py0.00330.0017L-Glutamine0.01460.0073BSA0.80.4CaCI2.2H2O0.02510.0126MgCI2?6H2O0.010.005BMEaminoacids2ml1mlMEMaminoacids1ml500卩l(xiāng)Sodiumlactate0.037(28.24ul)0.018(14.12^1)Pencillin0.00750.00375Strep0.00500.0025Phenolred少許少許PH:配法:注意：1.CacL2.2H20和MgCI2?6H20單獨(dú)溶解后緩慢倒入。2.定量后棄3.0285ml無離子水。成份mol/Lg/50ml甘露醇0.3mol/L2.733CaCl20.5mmol/L0.003675MgSO40.1mmol/L0.0006HEPES0.5mmol0.0059BSA0.025融合液 配方-2成份mol/Lg/50mlCaCl20.1mmol/LMgSO4組氨酸肌醇0.1mmol/L10mmol/L0.28mol/L融合液 配方-3成份mol/Lg/50ml甘露醇CaCl20.28mol/L0.1mmol/LMgSO4組氨酸0.1mmol/L10mmol/L配法注意:評(píng)價(jià):

成份：g/200mlDMEM2.700NaHCO30.740S/N0.01FBS20%water200mlPH：DMEM 配方2成份：g/200mlDMEM2.0NaHCO30.74Hepes0.24S/N0.01FBS20%water200mlPH：配法：注意：DMEM（高糖）中沒有Hepes?評(píng)價(jià):成份：g/100mlD/F121.5600NaHCO30.1200S/N0.005FBS15%water100mlPH:配法注意:評(píng)價(jià):

成份：NaCI58.48KCI74.56NaHPO?12H0358.14242KHPO42Na-Py136.10110.00NaHCO384.02CaCI.2H2O2MgCI.6H2OMgSO4?7HO60%乳酸鈉147.20203.30246.50112.10乳酸鈣.H20303.30Hepes238.30Glucose198.17EDTA.Na2372.20牛碘酸125.10果糖180.16Glutamine146.15PMSF174.2Leupiptin4成份：g/100mlg/50mlNaCI0.670.3352KCI0.02310.0116NaHCO30.22010.1101半Ca0.0550.0278L-Glutamine0.0150.0073Na-Py0.00220.0011BSA0.30.15BMEaminoacids2ml1mlMEMaminoacids1ml500ulS/N0.0050.0025Phenolred少許少許PH:配法注意評(píng)價(jià)配法注意評(píng)價(jià)成份CR1-BSACR1-FBSNaCL0.640.64KCL0.0380.038NaH2PO40.0120.012MgSO40.00960.0096NaHCO30.210.21Ca1/2Lactate0.05460.0546Na-Py0.00440.0044D-葡萄糖0.0270.1L-Glutamine0.0150.015(pen/strep)0.0015pg/ml0.005Hepes0.238V-BSA6mg/ml3mg/mlEAA(50)2ml2mlNEAA(100)1ml1mlPhenol-red少量少量FBS5%-10%PH:67CR1aa配方-1成份(100ml)(40ml)(50ml)NaCl0.670.2680.335KCl0.02310.009240.0116NaHCO30.220.0880.11Ca1/2Lactate0.05450.02180.0273Na-Py0.00440.001440.0018L-Glutamine0.01460.005840.0073BSA0.30.120.15EAA(50)2ml0.8ml1mlNEAA(100)1ml0.4ml0.5ml(S/N)0.005/0.0050.002/0.0020.0025/0.0025Phenol-redlittlelittlelittlePH:7.2-7.6配法:注意:下列試劑能添加?0.238Hepes0.238FBS 10%D-葡萄糖 0.027評(píng)價(jià):成份(100ml)(20ml)(50ml)NaCl0.640.1280.32KCl0.02310.00460.0116NaHCO30.22010.0440.1101Ca1/2Lactate0.05450.01090.0273Na-Py0.00220.00040.0011L-Glutamine0.01460.00290.0073MgCI2?6H200.01630.00330.0081K2HPO40.02070.00410.0104D-葡萄糖0.02970.00590.0149BSA0.60.120.3EAA(50)2ml0.4ml1mlNEAA(100)1ml0.2ml0.5ml(P/S)littlePhenol-redlittlePH:配法:注意：FBS添加量分別為5ml,lml,2.5ml評(píng)價(jià):69TALP基礎(chǔ)液配方T成份：g/100mlNaCI0.675KCI0.03NaHCO30.260Na-Py0.011NaH2P04（無水）0.0048Hepes0.2400CaCI.2H2O20.0295MgCI.6H2O0.0150L-glutamine0.0375S/N0.0075/0.005EDTA-Na0.0180Phenolred少量PH:配法：、，、亠—彳注意:1.CacL2.2H20和MgCI2?6H2O單獨(dú)溶解后緩慢倒入。2．NaH2P04（無水）0.0048/100ml評(píng)價(jià):獲能和受精液配方-2成份：50ml1．獲能液TALP基礎(chǔ)液50.0ml咖啡因0.022gGlucose0.0502.BO受精液TALP基礎(chǔ)液50.0mlHeparin0.005gBSA0.25gPH:配法：注意： 1.CacL2.2H20和MgCI2?6H20單獨(dú)溶解后緩慢倒入。70 Hank's液 配方一】成份：g/100mlNaCI0.80KCI0.04NaHCO30.035KH2PO40.006gGlucose0.1MgCI?6H0220.01或CaCI20.014MgS0?7H0420.01Phenolred0.002PH：配法：注意：Hank's液可以高壓滅菌。4°C下保存。配方-2D-Hank's液配方-2成份：g/500mlNaCI4.0KCI0.2NaHC030.175KH2P040.03gNo,HP04（無水）0.04275或NaHP04?7H0220.045PhenolredlittlePH：注意：

0.045NaHP04?7H00.04522配TE用71幾種胚胎培養(yǎng)液和緩沖液的成分含量g/L成份：WhitfenM16M2NaCI5.145.5335.533KCI0.360.3560.356KHP0420.160.1620.162NaHC031.92.1010.349MgS04?7H200.290.2930.293CaCI20.1900.190Hepes4.969乳酸鈣?5H200.53Na-Py0.0350.0360.036乳酸鈉(60%)3.70ml3.11ml3.11mlGlucose1.01.01.0BSA3.04.04.0Pencillin0.080.060.06Strep0.050.050.05Phenolred少許少許PH:配法:注意：1.CacL2.2H20和MgCI2?6H20單獨(dú)溶解后緩慢倒入。定量后棄3.0285ml無離子水。72.Insulin濃縮液稱取BSA0.0242g充分溶于20m1超純水中，然后再加入300ul醋酸（液體醋酸），向500mgInsulin管中加入0.5ml水，吸出加入25ml水中，再從25ml水中吸0.5ml水，如此反復(fù)多次，然后分裝，即為20mg/ml母液。100ul（1小管）Insulin加入100ml溶液中，其濃度為20ug/mlo400ul（1大管）Insulin加入100ml溶液中，其濃度為80ug/ml。細(xì)胞冷凍我們用90%的血清+5%DMS0+5%培養(yǎng)基，細(xì)胞復(fù)蘇很容易，絕大部分細(xì)胞存活。細(xì)胞融合細(xì)胞融合時(shí)操作要快，盡量少的刺激細(xì)胞。融合時(shí)的離心轉(zhuǎn)數(shù)一定要控制在800轉(zhuǎn)每分以下。我們?nèi)诤系臅r(shí)候使用的PEG1000,50%，再加少量的DMSOo我們?nèi)诤蠒r(shí)sp2/0跟要融合的細(xì)胞數(shù)之比為10的8次方比上10的7次方。用的是PEG1500，離心速度1000轉(zhuǎn)每分，對(duì)融合有影響嗎。線粒體的分離方法：勻漿細(xì)胞或加lysiibuffer（配方從網(wǎng)上找），吹打，然后480g離心5分鐘，取上清，再10000g離心10分鐘得到沉淀即線粒體。我們的方法是：刮下細(xì)胞后離心沉淀細(xì)胞，用BUFFER重懸細(xì)胞，放冰上30min，勻漿100次，1000G離心10min,取上清，在10000G離心10min,沉淀即為線粒體。細(xì)胞核提取取制備血管細(xì)胞懸液放于試管中，加五倍體積緩沖液10mmo1/1TrisHCL,pH7.4含10mo1/LNaC1,1.5mmo1/LMgcl/，加1%SDS10ul用勻漿器輕輕勻漿。加蔗糖液（0.34mo1/L，蔗糖10mo1/LMgC12）2份再勻漿1次，下面鋪一層0.88mo1/L蔗糖,800g離心5min，收集沉淀部分。在0.88mo1/L蔗糖液中再純化1次，然后將細(xì)胞懸于10m1蔗糖液（0.34mo1/L0.05mmo1.LMgC12）液中，用超聲波處理10S。將兩倍體積的0.88mo1/L蔗糖加于上述處理液中，800g離心30min收集沉淀部分。將沉淀加入0.88mo1/L蔗糖，5kg離心1h,沉淀部分為細(xì)胞核，將其保存于0.25mo1/L蔗糖,0.55mmo1/LMgC1中備用。細(xì)胞膜的提取1．取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。用