抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座

抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第1頁(yè)1、抗體（Antibody，Ab）：指能與對(duì)應(yīng)抗原特異性結(jié)合含有免疫功效球蛋白。抗體產(chǎn)生原因：機(jī)體免疫系統(tǒng)因病原菌、病毒感染，受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞，被活化B淋巴細(xì)胞經(jīng)增殖、分化產(chǎn)生漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成和分泌抗體?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第2頁(yè)2、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：含有抗體活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相同球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白。全部抗體均是Ig，但并非全部Ig都是抗體。Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)概念，抗體是生物學(xué)功效概念。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第3頁(yè)3、多克隆抗體：針對(duì)各種抗原決定簇抗體。因?yàn)椴≡懈鞣N抗原決定簇抗原物質(zhì)，由此刺激而產(chǎn)生抗體制劑是各種抗體混合物（其產(chǎn)量低，難以滿足臨床需要）?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第4頁(yè)4、單克隆抗體（MonoclonalAntibody，McAb）：采取B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，由純一單克隆細(xì)胞系產(chǎn)生，針對(duì)一個(gè)抗原決定簇，結(jié)構(gòu)和特異性完全相同高純度抗體稱單克隆抗體。特點(diǎn)：

a、含有高度特異性，均一性。

b、起源穩(wěn)定，可大量生產(chǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新伎倆?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第5頁(yè)二、臨床實(shí)踐中作用1、用于疾病診療

a、利用單克隆抗體檢測(cè)與一些疾病相關(guān)抗原，輔助臨床診療。

b、用放射性標(biāo)識(shí)單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診療?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第6頁(yè)2、McAb制劑用于疾病治療a、針對(duì)分化抗原CD3單克隆抗體對(duì)器官移植排斥反應(yīng)有顯著抑制效果。b、以McAb作為載體導(dǎo)向藥品可對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療。多年來(lái)經(jīng)過對(duì)McAb改造，消除其鼠源性（免疫原性）并降低其分子量，只保留其同抗原特異性結(jié)合活性，再用其制備導(dǎo)向藥品用于腫瘤治療，進(jìn)而提升了免疫導(dǎo)向療法效果，使該領(lǐng)域得以快速發(fā)展，當(dāng)前成為抗體應(yīng)用研究熱點(diǎn)。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第7頁(yè)第二節(jié)單克隆抗體制備單克隆抗體是將能產(chǎn)生抗體B淋巴細(xì)胞與含有沒有限增殖能力骨髓細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體融合，經(jīng)過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第8頁(yè)一、McAb制備普通程序

B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞↓融合雜交瘤細(xì)胞↓有限稀釋↓克隆化純一單克隆細(xì)胞系↓

McAb抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第9頁(yè)

抗原礦物油↓↓注射活鼠注射BalB/c小鼠刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)誘發(fā)產(chǎn)生骨髓瘤細(xì)胞↓↓制備取鼠脾臟→B淋巴細(xì)胞×骨髓瘤細(xì)胞(HGPR缺點(diǎn))↓↓融合（PEG）制取B淋巴細(xì)胞分裝多孔板選擇性培（HAT）↓↓親株死亡

B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖↓↓有限稀釋、克隆化制取多克隆抗體分離出單克隆細(xì)胞系→McAb抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第10頁(yè)二、McAb制備基礎(chǔ)技術(shù)（一）抗原制備制備針對(duì)特定抗原單克隆抗體，首先要制備用于免疫適當(dāng)抗原。1、化學(xué)合成法制備高純度單一抗原在已知抗原化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)情況下進(jìn)行。2、由病原菌、病毒或腫瘤細(xì)胞制備只能得到個(gè)別純化，甚至是極不純抗原混合物?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第11頁(yè)3、用整個(gè)細(xì)胞或病毒為免疫原刺激動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)后取其B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞融合雜交后，再經(jīng)篩選、克隆化，判別篩選出純一單克隆雜交瘤細(xì)胞系?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第12頁(yè)（二）免疫動(dòng)物品系選擇①多采取與骨髓瘤細(xì)胞供體相同品系動(dòng)物做為免疫動(dòng)物。因種系距離越遠(yuǎn)，產(chǎn)生雜交瘤越不穩(wěn)定。常采取BalB/C小鼠和Lou大鼠。②應(yīng)考慮所選動(dòng)物對(duì)所用抗原能否產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答，若不能，應(yīng)改用其它品系小鼠或大鼠?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第13頁(yè)（三）動(dòng)物免疫1、體內(nèi)免疫法適合用于抗原量多，免疫原性強(qiáng)情況，常見8~12周齡雌性鼠?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第14頁(yè)（1）顆粒性抗原（細(xì)胞抗原）免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔刺激動(dòng)物免疫。①首次免疫，腹腔注射107個(gè)細(xì)胞。②3周后，追加免疫1~2次，腹腔注射1~5×106個(gè)在緩沖鹽溶液中洗過細(xì)胞。③融合前4~5天，靜脈注射1~5×106個(gè)細(xì)胞?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第15頁(yè)（2）可溶性抗原①按每只小鼠10~100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合皮下注射。②3~4周后，100μg抗原在福氏完全佐劑中追加一次。③采集脾細(xì)胞前3天由靜脈注射最終一次100μg抗原。因免疫后第3天B淋巴細(xì)胞增殖率最高，是處于快速分裂期細(xì)胞，有利于融合后增殖。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第16頁(yè)福氏完全佐劑是由礦物油、乳化劑和殺死分枝桿菌組成油包水型乳化佐劑，對(duì)于刺激細(xì)胞免疫和一些試驗(yàn)性免疫尤其有效。為促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提升脾細(xì)胞分泌抗體能力，可在注射抗原同時(shí)加入細(xì)菌脂多糖。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第17頁(yè)2、體外免疫（1）特點(diǎn)

a、所用抗原量少（只需幾μg），免疫期短，僅4~5天，干擾原因少。

b、融合后產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞不夠穩(wěn)定。適合用于不能采取體內(nèi)免疫法情況，如制備人源性McAb；或者抗原免疫原性極弱且能引發(fā)免疫抑制時(shí)使用。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第18頁(yè)（2）基礎(chǔ)方法①采取4~8周齡BaLB/C小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液。②加入抗原使其濃度到達(dá)0.5~5μg/ml。③在5%CO2，37℃下培養(yǎng)4~5天。④分離脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第19頁(yè)3、其它免疫方法多年來(lái)，其它免疫方法研究較多，有脾內(nèi)免疫、腹貯植入、淋巴結(jié)注射、足墊注射等方法。其目標(biāo)主要是降低抗原用量和注射次數(shù)，縮短免疫周期?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第20頁(yè)（四）骨髓瘤細(xì)胞起源和特征1、起源（1）骨髓瘤細(xì)胞起源應(yīng)同免疫動(dòng)物種屬一致，普通不選擇產(chǎn)生本身免疫球蛋白細(xì)胞系。（2）鼠類骨髓瘤細(xì)胞系主要來(lái)自于BalB/C小鼠，少數(shù)來(lái)自于Lou大鼠。這些細(xì)胞系能夠在D-15或其它培養(yǎng)基中保留，在用于融合前應(yīng)保持其活力較高，當(dāng)前這類細(xì)胞系有商品供給。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第21頁(yè)常見鼠類骨髓瘤細(xì)胞系有NS-1、X45、X63、P3.653和SP2/O等。其最適培養(yǎng)細(xì)胞密度為2~5×105細(xì)胞/ml，細(xì)胞密度過高易引發(fā)細(xì)胞死亡?？捎门囵B(yǎng)基內(nèi)酚紅指示劑監(jiān)測(cè)，開始生長(zhǎng)時(shí)呈橙色，因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)，PH降低，當(dāng)變?yōu)榧凕S色時(shí)需補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基降低細(xì)胞密度，正常培養(yǎng)基顏色維持在黃橙色之間?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第22頁(yè)2、制取骨髓瘤細(xì)胞制?。河玫V物油注射入小鼠腹腔內(nèi)，誘發(fā)產(chǎn)生腹水癌型漿細(xì)胞。再由腹腔抽取腹水癌細(xì)胞，從中分離取得。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第23頁(yè)3、骨髓瘤細(xì)胞系特征①不能產(chǎn)生本身免疫球蛋白為防止雜交瘤細(xì)胞分泌抗體不純，骨髓瘤細(xì)胞不含有產(chǎn)生抗體能力。②應(yīng)為HGPRT缺點(diǎn)細(xì)胞系其細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸合成補(bǔ)救路徑必須喪失。即磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘧啶核苷酸激酶活力喪失，即HGPRT陰性細(xì)胞。③融合率高，輕易培養(yǎng)，所產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)且長(zhǎng)久穩(wěn)定。如：SP2/O和P3.653細(xì)胞系?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第24頁(yè)（五）細(xì)胞融合1、基礎(chǔ)方法：取適量B淋巴細(xì)胞（1×108/ml）與骨髓瘤細(xì)胞（2~3×107/ml）進(jìn)行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r(shí)間在2min內(nèi)。然后用HAT培養(yǎng)液將PEG融合液遲緩稀釋?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第25頁(yè)2、促進(jìn)融合條件①分子量在400~6000，濃度在10~60%之間PEG溶液都能使細(xì)胞發(fā)生融合。當(dāng)前常見分子量4000，濃度為40~50%PEG溶液為最正確。②在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO），以提升細(xì)胞接觸緊密性，提升融合率。但PEG和DMSO都對(duì)細(xì)胞有毒性，必須嚴(yán)格控制它們與細(xì)胞接觸時(shí)間，應(yīng)盡快用新配制培養(yǎng)液來(lái)稀釋助融劑并洗滌細(xì)胞。③經(jīng)過低速離心使細(xì)胞接觸更為緊密來(lái)提升融合率?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第26頁(yè)（六）選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合后，可產(chǎn)生各種融合細(xì)胞，B-B、B-瘤、瘤-瘤融合細(xì)胞，還有許多未融合親株細(xì)胞，它們均比B-瘤融合雜交瘤細(xì)胞有更強(qiáng)增殖能力，很易將其淘汰。所以，融合后必須馬上移入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第27頁(yè)（1）選擇性培養(yǎng)原理選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制。其中氨基喋呤（A）能阻斷DNA合成主要路徑。骨髓瘤細(xì)胞因是HGPRT缺失型，無(wú)DNA合成賠償路徑，所以瘤細(xì)胞和瘤-瘤融合細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。而B細(xì)胞和B-B融合細(xì)胞在這么離體組織培養(yǎng)條件下，無(wú)法生存幾天內(nèi)亦快速死亡。骨髓瘤細(xì)胞是HGPRT（磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）缺點(diǎn)型，但B細(xì)胞中有這種酶，所以B-瘤融合雜交瘤細(xì)胞含有HGPRT酶，可利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶（T）來(lái)合成DNA，使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第28頁(yè)（2）選擇性培養(yǎng)基礎(chǔ)方法①將融合反應(yīng)后細(xì)胞懸浮液于HAT培養(yǎng)液，加入到含有喂養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi)（0.1ml/孔）。②7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2~3天換液一次。換液時(shí)吸去1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量新鮮培養(yǎng)液。③第7~14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通RPMI1640完全培養(yǎng)液。④融合后培養(yǎng)第9~11天，就可對(duì)全部克隆生長(zhǎng)孔培養(yǎng)上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出產(chǎn)生抗體陽(yáng)性克隆。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第29頁(yè)（3）喂養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)融合細(xì)胞生長(zhǎng)。單個(gè)或少數(shù)雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常要加入喂養(yǎng)細(xì)胞才能使其繁殖。常見喂養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞（未經(jīng)免疫脾細(xì)胞）和胸腺細(xì)胞等。喂養(yǎng)細(xì)胞能釋放一些生長(zhǎng)刺激因子，并能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度依賴性。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞還含有去除死亡細(xì)胞和降低支原體污染作用。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第30頁(yè)（七）雜交瘤培養(yǎng)物（陽(yáng)性克?。┡卸ㄅc檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)而得到雜交瘤細(xì)胞，只有一個(gè)別細(xì)胞可能產(chǎn)生針對(duì)特異抗原目標(biāo)抗體，因抗體產(chǎn)生細(xì)胞只占全部脾細(xì)胞5%左右。所以，在培養(yǎng)9~11天左右，雜交瘤細(xì)胞集落直徑達(dá)1mm時(shí)，就應(yīng)對(duì)其能否分泌抗體進(jìn)行特異性判定，方便反抗體分泌陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化和擴(kuò)張。檢測(cè)時(shí)，取上清液二分之一體積用于抗體測(cè)定，其余再補(bǔ)加等量HT完全培養(yǎng)基?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第31頁(yè)1、判定與檢測(cè)方法要求應(yīng)快速、靈敏、特異性（專一性）強(qiáng)、微量、簡(jiǎn)便并一次能檢測(cè)大批標(biāo)本。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第32頁(yè)2、常見檢測(cè)方法有①、抗原直接結(jié)正當(dāng)：適合用于檢測(cè)能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合抗體。②利用第二抗體檢測(cè)方法：適合用于檢測(cè)能與可溶性和顆?？乖禺惤Y(jié)合抗體。有酶聯(lián)免疫法，放射免疫法，免疫電鏡技術(shù)，免疫熒光技術(shù)?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第33頁(yè)（1）抗原直接結(jié)正當(dāng)①選取對(duì)應(yīng)純一抗原，用125I進(jìn)行標(biāo)識(shí)，然后和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液混合，在一定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間（如4℃，1h等）②再經(jīng)過活性炭吸附、PEG6000沉淀或凝膠層析方法分離未結(jié)合抗原，純化抗體抗原免疫復(fù)合物。③最終經(jīng)過測(cè)定其復(fù)合物放射性強(qiáng)弱來(lái)進(jìn)行定性和定量測(cè)定?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第34頁(yè)（2）利用第二抗體檢測(cè)第二抗體：能與抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后形成復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合抗體，又稱抗抗體抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第35頁(yè)應(yīng)用第二抗體檢測(cè)雜交瘤分泌抗體時(shí)，需采取免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)。將第二抗體用125I放射性同位素標(biāo)識(shí)，或與酶連接，或與熒光染料連接，或用電子致密物質(zhì)加以標(biāo)識(shí)，以提升檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度。含有應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，輕易觀察，且能進(jìn)行定量和定性檢測(cè)特點(diǎn)?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第36頁(yè)①免疫熒光技術(shù)是利用結(jié)合有熒光素第二抗體與抗原抗體免疫復(fù)合物特異性結(jié)合，再檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)技術(shù)。常見熒光素有異氰基熒光素（FIC）、異硫氰基熒光素等?；A(chǔ)原理：熒光素可與第二抗體球蛋白中賴氨酸氨基結(jié)合，在藍(lán)紫光激發(fā)下發(fā)射出鮮明黃綠色或玫瑰紅色，而且結(jié)合熒光素第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后仍能發(fā)出熒光?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第37頁(yè)②酶聯(lián)免疫技術(shù)用酶標(biāo)識(shí)抗體或第二抗體來(lái)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)或第二免疫反應(yīng)，檢測(cè)酶標(biāo)識(shí)抗體或第二抗體是經(jīng)過酶與特殊底物反應(yīng)來(lái)進(jìn)行（顏色改變，氧化還原電位改變等）。●通常見酶有：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶等。應(yīng)用發(fā)展最快是酶聯(lián)免疫吸附法，是檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體一個(gè)最有效方法?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第38頁(yè)③放射免疫技術(shù)是應(yīng)用同位素標(biāo)識(shí)第二抗體與抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行特異結(jié)合，再經(jīng)過檢測(cè)放射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定性定量檢測(cè)抗體方法。含有高靈敏度和血清反應(yīng)高特異性優(yōu)點(diǎn)。但需要γ-計(jì)數(shù)器等檢測(cè)放射性特殊儀器?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第39頁(yè)④免疫電鏡技術(shù)：是利用電子致密物質(zhì)標(biāo)識(shí)第二抗體后再與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，最終用電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第40頁(yè)（3）免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)方法步驟①將特定純一抗原（20μg/ml）吸附在微量滴定板小孔中（每孔50~100μl抗原溶液），37℃溫育2h或4℃過夜，傾去抗原溶液，用DPBS緩沖液洗滌小孔3次，這時(shí)小孔上已粘附了特定抗原。②用一個(gè)不能與待檢測(cè)抗體結(jié)合蛋白質(zhì)飽和小孔內(nèi)剩下蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)（1%牛血清蛋白DPBS緩沖液250μl），然后一樣用DPBS緩沖液洗滌小孔3次?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第41頁(yè)③加入待檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清液（每小孔加入上清液50~100μl），在37℃下溫育2h，使待測(cè)抗體與抗原充分結(jié)合。傾去上清液，用DPBS緩沖液洗滌3次。④加入用免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)標(biāo)識(shí)第二抗體，使其與已形成抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，然后用對(duì)應(yīng)方法檢測(cè)。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第42頁(yè)如：采取酶聯(lián)免疫技術(shù)每小孔加入50~100μl酶與第二抗體連接物溶液，37℃下反應(yīng)30min，使第二抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。然后，再用含0.05%Tween-20DPBS液洗滌小孔5次，再加入50~100μl酶底物溶液，使底物與[抗原-抗體]-第二抗體-酶復(fù)合物在一定條件下反應(yīng)。最終用多用掃描儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物光密度，再換算成待測(cè)抗體濃度?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第43頁(yè)（八）雜交瘤細(xì)胞克隆化篩選出陽(yáng)性克隆中（細(xì)胞集落），可能含有不分泌抗體細(xì)胞，或有多株分泌不一樣抗體細(xì)胞。而且剛?cè)诤先〉秒s交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失。所以，必須盡早進(jìn)行克隆化?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第44頁(yè)克隆化：分離取得單細(xì)胞并將單細(xì)胞經(jīng)過無(wú)性繁殖而取得細(xì)胞集團(tuán)整個(gè)過程。這些細(xì)胞集團(tuán)中每個(gè)細(xì)胞生物學(xué)特征和功效是完全相同。普通融合判定后取得雜交瘤細(xì)胞集落要經(jīng)約3次克隆化，才能到達(dá)100%孔內(nèi)均為單克隆抗體陽(yáng)性細(xì)胞?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第45頁(yè)常見克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。1、有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞集落制成單細(xì)胞懸浮液，經(jīng)稀釋到一定細(xì)胞濃度后，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中在理論上只含有一個(gè)細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)、檢測(cè)和判定后深入分離篩選?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第46頁(yè)①第一次克隆化時(shí)要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后克隆化可用不含HTRPMI1640培養(yǎng)液。②因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞難以存活，克隆化培養(yǎng)時(shí)需加入喂養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長(zhǎng)。③抗體檢測(cè)、判別?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第47頁(yè)2、軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右瓊脂糖凝膠，將雜交瘤集落單細(xì)胞懸浮液加入其中，細(xì)胞分裂后形成小球樣團(tuán)塊。因?yàn)榕囵B(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團(tuán)塊經(jīng)打壞后再制成單細(xì)胞懸浮液，移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)和判定。用這種方法能夠吸出大量克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進(jìn)行克隆化輕易成功?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第48頁(yè)（九）雜交瘤細(xì)胞與McAb判定1、雜交瘤細(xì)胞判定對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，不但可作為判定指標(biāo)，還能幫助了解其分泌抗體能力?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第49頁(yè)（1）雜交親本染色體特點(diǎn)鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲點(diǎn)染色體。小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)變異較大，SP2/O細(xì)胞系為62~68，NS-1細(xì)胞系為54~64，大多數(shù)為非整倍體性，而且有中部和亞中部著絲點(diǎn)染色體。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第50頁(yè)（2）雜交瘤細(xì)胞染色體特點(diǎn)①雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目靠近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目標(biāo)總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲點(diǎn)染色體外，還有少數(shù)中著絲點(diǎn)或亞中著絲點(diǎn)標(biāo)志染色體。②染色體數(shù)目較多且又比較集中雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗體，而染色體數(shù)目少且較分散雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力較低?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第51頁(yè)2、McAb判定（1）免疫球蛋白類和亞類判定因?yàn)椴灰粯宇惡蛠嗩惷庖咔虻鞍咨飳W(xué)特征差異較大，所以要對(duì)制備雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生McAb進(jìn)行Ig類和亞類判定。方法：可用羊或免抗Ig不一樣類和亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行判定。抗體制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第52頁(yè)（2）McAb與對(duì)應(yīng)抗原親和力測(cè)定可為正確選擇不一樣用途McAb提供依據(jù)。（3）對(duì)McAb進(jìn)行特異性、純度和識(shí)別抗原相對(duì)分子質(zhì)量等進(jìn)行測(cè)定?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第53頁(yè)（十）單克隆抗體大量制備McAb大量制備有體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法。1、體內(nèi)誘生法可取得5~20mg/ml抗體，當(dāng)前多采取。（1）動(dòng)物選擇：選取BALB/C小鼠來(lái)制備?？贵w制藥醫(yī)學(xué)知識(shí)講座第54頁(yè)（2）基礎(chǔ)方法：①在接種雜交瘤細(xì)胞前1~2周，先給小鼠腹腔注射0.5ml降植烷（或液體石蠟），以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細(xì)胞良好增殖環(huán)境。②注射1×106雜