新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)

OricellTMOricellTM新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第1頁最新產(chǎn)品：1.ES成神經(jīng)元分化試劑盒；2.ES成心肌分化試劑盒；3.ES成肝實質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；4.MSC成肝實質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；5.NSC成神經(jīng)元分化試劑盒；6.NSC成星型膠質(zhì)細(xì)胞分化試劑盒；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第2頁目錄：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)和技術(shù)介紹成體干細(xì)胞常見問題與處理方案1.細(xì)胞和培養(yǎng)（干細(xì)胞、原代細(xì)胞產(chǎn)品和試劑）2.細(xì)胞分化（多個方向標(biāo)準(zhǔn)方法）3.細(xì)胞示蹤（GFP/RFP和定制方法）干細(xì)胞凍存和復(fù)蘇方案干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第3頁Stemcell間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）MesenchymalStemCells是一個多能干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞（ES）EmbryonicStemCells是一個全能干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）NeuralStemcell是一個神經(jīng)系統(tǒng)多能干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第4頁P(yáng)rimarycell神經(jīng)元系統(tǒng)（多個起源和物種，海馬、皮層）星型膠質(zhì)細(xì)胞（多個物種皮層）肝實質(zhì)細(xì)胞；肝臟前體細(xì)胞；分離其它客戶定制細(xì)胞；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第5頁胚胎干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第6頁胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcellES,細(xì)胞)是指胚泡期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出還未分化、能在體外培養(yǎng)、含有發(fā)育全能性早期胚胎細(xì)胞無限增殖、自我更新可分化為三個胚層起源各種組織及細(xì)胞類型新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第7頁ES細(xì)胞起源：5d胚胎ABCD新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第8頁ES生長特征鼠：生長快，胰酶消化，2天傳一次，可一傳多。復(fù)蘇率較高。人：生長慢，機(jī)械分離，7~10天傳一次，相對較少。1:4~1:6。復(fù)蘇率低。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第9頁表面抗原表示Oct-4：一個轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)育全能性標(biāo)志。堿性磷酸酶（AKP）：常被用來作為判定ES細(xì)胞及其分化是否主要標(biāo)志。SSEA-1：小鼠ES表示SSEA-3、SSEA-4：人ES表示新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第10頁染色體結(jié)構(gòu)核型分析：正常穩(wěn)定二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。46，XX；46，XY新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第11頁核型檢測：46，XX新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第12頁多能性和全能性

體內(nèi)：畸胎瘤試驗

特定抗擬胚體特定條件誘體免疫導(dǎo)/自然分化組化體外分化去除喂養(yǎng)層細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第13頁全能性體內(nèi)：畸胎瘤試驗體外：去除喂養(yǎng)層細(xì)胞擬胚體（EB,embryoidbody。為ES細(xì)胞懸浮生長自發(fā)分化形成,含有內(nèi)中外三個胚層組織,能基本上模擬體內(nèi)發(fā)育過程)；貼壁誘導(dǎo)；特定條件誘導(dǎo)/自然分化（除去LIF）各胚層特定抗體免疫組化檢測新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第14頁體內(nèi)：畸胎瘤檢測

血管組織呼吸道上皮鱗狀上皮腺體組織 脂肪組織新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第15頁體內(nèi)分化外胚層：鱗狀上皮、神經(jīng)組織等中胚層：骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等內(nèi)胚層：柱狀上皮、腸管樣組織等新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第16頁體外：分化形態(tài)

ES貼壁誘導(dǎo)

EB約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第17頁129MouseHumanES新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第18頁免疫組化檢測

Nestin(ectoderm)Troponin(mesoderm)Tubulin(ectoderm) AFP(endoderm)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第19頁神經(jīng)分化：貼壁誘導(dǎo)第2天神經(jīng)分化：貼壁誘導(dǎo)第5天新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第20頁IHC

β‐3

Tublin

新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第21頁特異性抗原表示情況抗原人ES鼠ESOct-4 + +Nanog + +SSEA-1

ˉ

+SSEA-3 +

ˉSSEA-4 +

ˉ不停有新蛋白標(biāo)識被發(fā)覺和論證新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第22頁堿性磷酸酶染色新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第23頁小鼠ES流式圖新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第24頁染色體結(jié)構(gòu)核型分析：正常穩(wěn)定二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。人（46，XX），鼠（40，XY)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第25頁性別分析性別經(jīng)過PCR方法判定，目標(biāo)基因是基因組DNAY染色體相關(guān)基因Tspy，陽性對照用X染色體相關(guān)基因PolA1以及Gapdh。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第26頁ESClonemES-GFPHumanES-GFP新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第27頁MEF細(xì)胞：ES成功一個主要原因Cyagen提供MEF經(jīng)過γ-irradiation處理，確保全部細(xì)胞都完全失去增殖能力，又能夠保證最正確支持和分泌能力，同時沒有任何化學(xué)有毒物質(zhì)污染，為你ES細(xì)胞提供最正確生長環(huán)境；為ES增殖提供各種因子；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第28頁試驗室調(diào)查普遍結(jié)果：據(jù)Cyagen對多個試驗室使用53個ES細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測，45%被支原體污染；沒有嚴(yán)格質(zhì)量控制和環(huán)境控制情況下制作MEF：有35%以上是攜帶支原體，這個數(shù)據(jù)還依據(jù)操作技術(shù)不成熟，使用動物污染嚴(yán)重情況，風(fēng)險也會大大增加；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第29頁絲裂霉素‐C（MITOMYCIN

C）：

A、長久接觸絲裂霉素‐C，藥品毒性將嚴(yán)重影響操作人員身體健康；（單位量10‐30ug/ml處理20個10cm

dish需要3‐6mg）

B、絲裂霉素‐C溶液不穩(wěn)定，4℃保留，也會快速降解，造成處理細(xì)胞不能完全失活，這將嚴(yán)重影響后面試驗分析；

C、絲裂霉素‐C殘留，微量絲裂霉素‐C也會造成ES細(xì)胞增殖抑制和分化；（因為其是細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合劑）新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第30頁

OCT-4(+)SSEA-1(-)SSEA-4(+)

A AA

B BB

C CC新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第31頁Es細(xì)胞培養(yǎng)過程：怎樣準(zhǔn)備狀態(tài)良好MEF細(xì)胞；消化傳代過程；怎樣去除MEF細(xì)胞；挑克隆操作；怎樣準(zhǔn)備用于進(jìn)行各種基因操作細(xì)胞；怎樣準(zhǔn)備用于進(jìn)行注射細(xì)胞；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第32頁怎樣準(zhǔn)備狀態(tài)良好MEF細(xì)胞；取胚胎（13.5d）：去除頭部和四肢；剪碎后加入0.125%胰酶進(jìn)行消化到組織塊基本消失；終止消化并離心搜集細(xì)胞；（檢測細(xì)胞支原體）重懸接種：5000-10000cells/cm2第二天換液后培養(yǎng)3天，進(jìn)行γ-射線照射；凍存檢測；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第33頁生產(chǎn)過程控制：動物：胚胎孕齡；動物污染物；細(xì)胞支原體；細(xì)胞支持能力；細(xì)胞失活；蛋白表示檢測；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第34頁適當(dāng)MEF密度：細(xì)胞貼壁效率；細(xì)胞分泌能力；細(xì)胞大??；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第35頁最正確密度受到很多原因影響：25000cells過密：克隆生長遲緩，克隆小，不過立體感好；過稀：克隆輕易分化，邊緣不清楚，不過克隆增殖稍快；最正確密度：克隆邊緣清楚，細(xì)胞輕易增殖，大小均一。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第36頁怎樣去除MEF：無喂養(yǎng)層培養(yǎng)：不過代數(shù)非常有限，基本不能長期傳代；MEF培養(yǎng)：能夠長久培養(yǎng)，細(xì)胞狀態(tài)好，不影響細(xì)胞全能性；原理：利用不一樣細(xì)胞貼壁時間差異；步驟：消化后離心重懸，在包被明膠皿上貼壁30min，輕輕吸出上清，接入另外一個包被有明膠皿中30min，再吸出上清中細(xì)胞；并在包被皿上培養(yǎng)一段時間，就能夠去除大部分MEF細(xì)胞；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第37頁影響原因：克隆狀態(tài)：分化細(xì)胞貼壁性會大大增加；MEF狀態(tài)：MEF假如有大量碎片也會增加液體粘稠度干擾細(xì)胞正常分離；消化效果：假如有MEF沒有和ES很好分開，會將ES一起貼在皿上；細(xì)胞團(tuán)和顆粒：顆粒大細(xì)胞團(tuán)會造成細(xì)胞快速沉淀并造成細(xì)胞貼壁；假如效果不佳能夠進(jìn)行屢次重復(fù)，不過會大大降低細(xì)胞回收率；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第38頁ES細(xì)胞傳代：細(xì)胞克隆出現(xiàn)足夠大，細(xì)胞邊緣開始出現(xiàn)不清楚，細(xì)胞克隆出現(xiàn)部分分化情況；普通周期是3-5天；傳代百分比依據(jù)細(xì)胞克隆大小和細(xì)胞生長狀態(tài)，百分比為1：5-1：10；消化時候觀察普通以MEF為標(biāo)準(zhǔn)，假如MEF基本上已經(jīng)開始脫壁就能夠終止消化；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第39頁?????挑克隆技術(shù)：當(dāng)克隆大部分出現(xiàn)分化時候；克隆大小不均而且生長遲緩；注意事項：拉針（要注意末端大小）或使用1ml注射器；在體視鏡下操作，要在解剖超凈臺中操作；注意環(huán)境，防止污染；提取克隆要消化后才能進(jìn)行接種；單克隆培養(yǎng)周期長，要更有耐心；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第40頁用于ES囊胚注射細(xì)胞控制：低代數(shù)：（細(xì)胞全能型和基因變異和染色體變異）低分化程度：（細(xì)胞分化會大大影響細(xì)胞最終整合效率和生殖遺傳百分比）最低控制標(biāo)準(zhǔn)：正常核型，細(xì)胞各種分化蛋白沒有表示，各種ES正常表示蛋白正常；含有成瘤性；增殖速度快；無任何外源污染；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第41頁其它類型成體干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第42頁間質(zhì)干細(xì)胞是當(dāng)前研究最多干細(xì)胞起源研究方向：不停有文章報道從不一樣組織分離出MSC，整體方向是有利臨床廣泛取材和減少病人痛苦；

與組織工程結(jié)合研究方式，最主要是怎樣提高與組織相容性和提升在向多個方向分化控制，怎樣成為一個真正組織；臨床治療研究，也是當(dāng)前細(xì)胞治療研究熱點，國內(nèi)主要治療細(xì)胞；基因研究載體，干細(xì)胞分化機(jī)制模型；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第43頁Cyagen能夠提供幫助：起源研究：基本上從體內(nèi)各個組織中發(fā)覺非常多干細(xì)胞，包含肌肉，肺部，肌腱，血管，皮膚等，而這些細(xì)胞都含有含量非常少，同時也具有非常顯著組織特意性，表示非常多組織特異性蛋白；（提供高難度提取服務(wù)）組織材料學(xué)：結(jié)合納米材料和其它生物學(xué)材料，用于研究含有臨床前景材料；（細(xì)胞相容性，蛋白表示，細(xì)胞分化分析等）臨床研究：怎樣從單一起源取得大量穩(wěn)定而且維持良好生物學(xué)特征細(xì)胞，同時確保生物安全性；（提升全套技術(shù)支持和服務(wù)）新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第44頁間質(zhì)干細(xì)胞定義：起源于中胚層早期細(xì)胞，能夠分化為各種中胚層和神經(jīng)外胚層起源細(xì)胞。起源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。起源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第45頁分離方法骨髓人，猴子，犬

密度梯度離心法：不一樣顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不一樣區(qū)域上形成區(qū)帶方法。大鼠，小鼠，兔子：全骨髓貼壁法脂肪等組織：人、大鼠、小鼠：酶消化法新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第46頁判定方法

不一樣物種表面標(biāo)識差異：表面標(biāo)志人,猴子大鼠小鼠陽性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44，CD166陰性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱陽:CD34，CD45新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第47頁傳代能力有限增殖，伴隨傳代次數(shù)增加，分化能力逐步降低，按照1：2百分比：人：1~2代到達(dá)純化，最多15~20代。大鼠：3~4代到達(dá)純化，最多20~25代。小鼠：7~8代到達(dá)純化，最多25~30代。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第48頁間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)問題/處理方案?BMSCs：起源長骨骨髓，體內(nèi)與造血功效有緊密關(guān)系，不過也存在牙髓和其它短骨里面，缺點是取材時給病人痛苦較多；?ADSCs：起源全身脂肪組織，包含皮下和內(nèi)臟脂肪墊；起源屬于微創(chuàng)方法取材，主要是起源于抽脂減肥手術(shù)；?其它起源間質(zhì)干細(xì)胞：胰腺干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、肝 臟干細(xì)胞、肌腱干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等；還有新生兒

臍帶、胎盤等其它組織；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第49頁?細(xì)胞形態(tài)：不一樣組織起源間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)多樣，基本無法從細(xì)胞形態(tài)上進(jìn)行有效區(qū)分；?表面抗原：不一樣起源細(xì)胞表面標(biāo)識會有差異BMSC

和ADSCs區(qū)分就是CD106（+/-）和CD49d（-/+）；?分化能力：會有較大波動，伴隨不一樣個體、不一樣組織起源會有改變；?培養(yǎng)液選擇：不一樣起源也是不一樣！新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第50頁間質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征P040XP340X新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第51頁骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向分化為脂肪細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第52頁梭形、纖維樣細(xì)胞原代：克隆樣生長傳代后：勻質(zhì)、渦旋狀排列Human Dog

RatMonkeyMouse Rabbit新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第53頁間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)：1.增殖速度改變；2.細(xì)胞分化影響；3.形態(tài)學(xué)改變；4.克隆形成率改變；5.基因表示影響；6.使用特殊要求；7.價格原因；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第54頁怎樣選擇間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)？?基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇:依據(jù)細(xì)胞生長和要求參考文章進(jìn)行優(yōu)化，需要添加部分氨基酸或者糖；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第55頁?血清篩選：應(yīng)該利用10株以上細(xì)胞，進(jìn)行克隆形成率、生長曲線、分化能力比較；?添加物：營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、抗生素、細(xì)胞因子添加；優(yōu)選專業(yè)血清普通胎牛血清普通牛血清新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第56頁細(xì)胞培養(yǎng)過程常見問題細(xì)胞增殖速度下降：間質(zhì)干細(xì)胞不是無限細(xì)胞系，最正確試驗窗口是P3-P8；細(xì)胞老化：培養(yǎng)環(huán)境不適合（包含培養(yǎng)表面和培養(yǎng)液）；胰酶對細(xì)胞表面蛋白傷害；缺乏相關(guān)生長因子；細(xì)胞本身端粒影響；細(xì)胞分化：血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體外培養(yǎng)時間影響；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第57頁間質(zhì)干細(xì)胞常見污染和控制細(xì)胞污染、造血系統(tǒng)細(xì)胞；取材起源污染：病毒、或者其它感染；支原體污染：隱性污染，普通難以覺察，造成細(xì)胞狀態(tài)不停下降，影響細(xì)胞正常增殖，擴(kuò)散和污染環(huán)境，影響最大；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第58頁神經(jīng)干細(xì)胞廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內(nèi)可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第59頁神經(jīng)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第60頁神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特征Nestin陽性自動聚集成球，球體表面存在絨毛懸浮生長無血清培養(yǎng)，血清替換物，bFGF，EGF新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第61頁神經(jīng)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第62頁NSC存在神經(jīng)系統(tǒng)中干細(xì)胞分化：神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第63頁NSC取材和培養(yǎng)鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）：起源于14.5d胚胎大腦GE區(qū)；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第64頁大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-懸浮培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞-貼壁培養(yǎng)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第65頁使用Cyagen神經(jīng)干分化試劑使用血清誘導(dǎo)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第66頁NSC操作關(guān)鍵點：傳代培養(yǎng)：1、懸浮培養(yǎng)必須控制球大小，傳代時自然沉降，去除其中大球；能夠使用機(jī)械方法；2、懸浮法培養(yǎng)能夠取得大量細(xì)胞；3、貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞能夠用于轉(zhuǎn)基因操作，不過費(fèi)用很高；4、整個培養(yǎng)過程必須確保無血清；5、確保細(xì)胞純度，取得高擴(kuò)增率；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第67頁干細(xì)胞分化機(jī)理和相關(guān)技術(shù)產(chǎn)品新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第68頁干細(xì)胞分化機(jī)理WildtypemousefibroblastsMouseFibroblastsCarryingMyf5BAC新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第69頁干細(xì)胞分化能力判定分化試劑（檢測干細(xì)胞尺）：必須穩(wěn)定，不然結(jié)果波動非常大，將無法分析；每次配置分化試劑：必須是有陽性對照進(jìn)行檢測，確保有分化誘導(dǎo)能力再用于檢測其它細(xì)胞；不一樣物種間最正確誘導(dǎo)物濃度不一樣，所以不一樣物種間最好做一下濃度上面優(yōu)化；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第70頁新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第71頁新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第72頁干細(xì)胞分化常見問題分化百分比影響原因；?細(xì)胞群分化能力：整個細(xì)胞群體中干細(xì)胞比率決定；?代數(shù)：細(xì)胞分化比率隨代數(shù)增加下降；?誘導(dǎo)系統(tǒng)穩(wěn)定性：誘導(dǎo)組方、藥品效價和配置過程影響；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第73頁分化時間影響原因成骨：2-4周成脂：2-4周成軟骨：3-4周不一樣物種：人和大鼠輕易誘導(dǎo)，小鼠需要更長時間，狗和兔子誘導(dǎo)時間波動大；動物大小影響：人和靈長類、狗等胚胎期或者新生代幼體分化率偏低；而成體起源MSC分化能力高！臍帶、臍血MSC分化百分比較低。細(xì)胞質(zhì)量影響才是影響分化關(guān)鍵關(guān)鍵！新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第74頁分化影響原因不一樣物種：波動很大，不能橫向比較；不一樣提取方法：操作方法差異，造成細(xì)胞群組成差異；不一樣培養(yǎng)系統(tǒng)：影響細(xì)胞形態(tài)、大小、克隆形態(tài)也不一樣，分化能力也有差異；使用a-MEM會降低干細(xì)胞成脂肪分化；不一樣代數(shù)：分化也是會有波動，同時各個方向分化改變速度不一樣時；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第75頁Cyagen提供完善分化系統(tǒng)骨、脂肪、軟骨分化：囊括了多個物種、各種來源干細(xì)胞分化試劑；穩(wěn)定高效：干細(xì)胞金指標(biāo)；心肌分化、神經(jīng)分化OricellTM提供定制分化服務(wù)；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第76頁干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)處理方案應(yīng)用方向；?大動物體內(nèi)試驗：包含靈長類等，需要細(xì)胞量都是108這個數(shù)量級以上；?多組動物試驗：要取得愈加有說服力結(jié)果；?大規(guī)模篩選：中藥成份篩選、藥品單體試驗；?臨床使用干細(xì)胞：干細(xì)胞最終應(yīng)用；OricellTM提供大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第77頁OricellTM大規(guī)模培養(yǎng)實現(xiàn)使用T175培養(yǎng)：數(shù)量上能夠直接增加，不過增加污染風(fēng)險，系統(tǒng)不穩(wěn)定；使用多層培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶；使用小型細(xì)胞培養(yǎng)罐：細(xì)胞擴(kuò)增輕易不過收獲困難，條件控制不成熟；密閉細(xì)胞工廠系統(tǒng)：全密閉系統(tǒng)，能夠用增加數(shù)量方法放大規(guī)模，不過成本較高，需要環(huán)境控制系統(tǒng)；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第78頁????干細(xì)胞質(zhì)量控制和處理方案；表面標(biāo)識與細(xì)胞分化：表面標(biāo)識有哪些關(guān)鍵標(biāo)識：現(xiàn)在當(dāng)前并未有一個非常特異得到公認(rèn)表面抗原分子；Cyagen研究發(fā)覺，表面抗原分子和分化不含有穩(wěn)定相關(guān)性；表面抗原改變主要集中在前期和高代數(shù)時改變；分化能力改變主要和代數(shù)相關(guān)，和表面標(biāo)識有半相關(guān)性；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第79頁干細(xì)胞增殖能力指標(biāo)；?生長曲線：表現(xiàn)細(xì)胞自我更新能力一個指標(biāo)；?克隆形成率：表示含有較強(qiáng)自我更新能力細(xì)胞百分比指標(biāo)；屬于和干細(xì)胞“Self-Renew”相關(guān)；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第80頁?????體內(nèi)試驗使用細(xì)胞污染物控制細(xì)胞污染物控制和檢測方法；細(xì)胞間污染：不能不一樣細(xì)胞一起操作，使用相同一瓶試劑；操作最好間隔1個小時；細(xì)菌污染：全部使用培養(yǎng)試劑進(jìn)行無菌檢測；真菌污染：嚴(yán)重影響細(xì)胞體內(nèi)試驗，一旦出現(xiàn)極難處理；內(nèi)毒素：對全部使用器械、容器、管道都進(jìn)行處理，250度干烤或者是用堿洗；外源異物污染：防止使用玻璃操作，使用有認(rèn)證產(chǎn)品，個人防護(hù)；同時使用前對細(xì)胞懸液中進(jìn)行觀察，看是否有顆粒；新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第81頁大規(guī)模和有穩(wěn)定質(zhì)量控制細(xì)胞應(yīng)用動物體內(nèi)試驗和處理方案新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第82頁干細(xì)胞動物體內(nèi)試驗新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第83頁????干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用注意事項凍存細(xì)胞是否能夠復(fù)蘇直接用于試驗；理論上是可行，不過對凍存液要求很高；復(fù)蘇率到達(dá)90%以上，減低死亡細(xì)胞影響；MSC類細(xì)胞普通凍存液復(fù)蘇后細(xì)胞非常脆弱，最好經(jīng)過一次培養(yǎng)；需要清洗：去血清和DMSO（2.5-11g/kg），同時降低內(nèi)毒素；OricellTMNCR凍存液、DMSO-Free凍存液新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第84頁細(xì)胞自然成團(tuán)對體內(nèi)試驗影響造成血管內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞栓塞，直接造成動物急性死亡；會在肺部、肝積聚，減低器臟功效，長久會有纖維化風(fēng)險；細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下，會自然聚集成渙散團(tuán)；死細(xì)胞多，釋放DNA會造成細(xì)胞聚成大團(tuán)；1.一小時內(nèi)使用：2.細(xì)胞充分吹勻或者使用濾網(wǎng)：200-250目3.培養(yǎng)過程中細(xì)胞絕對不能過密：80%最正確4.細(xì)胞代數(shù)不能太高<P5新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第85頁體內(nèi)試驗實現(xiàn)方法：注射方法和溶劑；局部注射：肌肉、肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)；全身注射：鼠尾靜脈、兔子耳緣靜脈等；溶劑：培養(yǎng)液、PBS、HBSS、生理鹽水；污染物控制；（內(nèi)毒素、熱源、真菌污染、外源物質(zhì)污染影響）新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第86頁體內(nèi)研究：示蹤作用GFP/RFP干細(xì)胞研究中主要作用干細(xì)胞移植后在體內(nèi)生物學(xué)改變（如遷移、分布、增殖、分化等）都離不開對植入干細(xì)胞示蹤和定量技術(shù)。GFP或RFP因為檢測方便、表示穩(wěn)定和不影響細(xì)胞功效等特點，當(dāng)前在干細(xì)胞移植研究中GFP或RFP主要性越來越得到重視。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第87頁GFP、RFP標(biāo)識綠色熒光蛋白（GFP）紅色熒光蛋白（RFP）擬人化綠色熒光蛋白（hrGFP）新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第88頁GFP、RFP標(biāo)識優(yōu)點檢測方便：不需要底物或輔因子,可對活體檢測,因而可對被標(biāo)識對象進(jìn)行動態(tài)、連續(xù)觀察。熒光穩(wěn)定，不易淬滅，尤其是hrGFP對細(xì)胞毒性較小新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第89頁GFP標(biāo)識人胚胎干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第90頁GFP/RFP標(biāo)識小鼠胚胎干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第91頁GFP標(biāo)識間質(zhì)干細(xì)胞成人間質(zhì)干細(xì)胞

胎兒間質(zhì)干細(xì)胞食蟹猴間質(zhì)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第92頁F344大鼠間質(zhì)干細(xì)胞SD大鼠間質(zhì)干細(xì)胞Wistar大鼠間質(zhì)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第93頁神經(jīng)干細(xì)胞人神經(jīng)干細(xì)胞小鼠神經(jīng)干細(xì)胞GFP標(biāo)識小鼠神經(jīng)干細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第94頁干細(xì)胞應(yīng)用研究賽業(yè)（廣州）生物科技有限企業(yè)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第95頁干細(xì)胞研究為何引發(fā)這么大重視肌萎縮側(cè)索硬化病(ALS)Alzheimer’sDisease新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第96頁造血干細(xì)胞移植我國白血病年發(fā)病率為4/10萬人，每年新增約4萬名白血病患者,其中約2萬名是兒童。我國長江流域以南兩廣和云貴地域地中海貧血發(fā)病率高達(dá)10%以上,廣東省每年新增重度beta-地貧患兒400名。一些重度本身免疫性疾病,如紅斑狼瘡,多器官硬化等發(fā)病率更高。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第97頁造血干細(xì)胞移植存在問題移植后造血恢復(fù)遲緩移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,GVHD)是骨髓移植(BMT)后出現(xiàn)多系統(tǒng)損害(皮膚、食管、胃腸、肝臟等)全身性疾病，是造成死亡主要原因之一。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第98頁間質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用促進(jìn)造血和免疫功效重建治療GVHD心腦血管疾病免疫系統(tǒng)疾病新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第99頁間質(zhì)干細(xì)胞（MSC）優(yōu)點間質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中就是造血干細(xì)胞支持細(xì)胞MSC低免疫原性MSC免疫調(diào)整作用，降低免疫應(yīng)答MSC誘導(dǎo)免疫耐受MSC表示各種趨化因子受體，體內(nèi)可趨化遷移到受損組織和器官新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第100頁間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血恢復(fù)和免疫重建，降低GVHD前期動物試驗顯示:1.MSC促進(jìn)受體鼠外周血白細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞顯著恢復(fù)；2.幫助胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)重建，加速T細(xì)胞恢復(fù)3.降低GVHD發(fā)生率及嚴(yán)重程度新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第101頁

MSC治療慢性GVHD臨床試用

MSC治療難治性cGVHD臨床試用

治療慢性GVHD病人10例，其中7例病人口腔潰瘍、皮 疹、肝功效異常、關(guān)節(jié)酸痛等癥狀有顯著好轉(zhuǎn)。MSCs輸注量:

異體MSCs數(shù) 自體MSCs數(shù)臍血輸注量： 有核細(xì)胞

CD34+細(xì)胞4×106/kg8×106/kg6×107/kg 5×105/kg新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第102頁MSC輸注對移植物抗宿主病療效新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第103頁間質(zhì)干細(xì)胞其它臨床應(yīng)用缺血性心臟病，如心肌梗死缺血性腦病，如腦梗死，缺血缺氧性腦病肝臟疾病，如肝纖維化腎臟疾病，如急性腎衰新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第104頁組織工程應(yīng)用納米材料：成骨誘導(dǎo)，表面結(jié)合DEX-Vc新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第105頁與納米材料結(jié)合軟骨細(xì)胞新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第106頁組織工程存在問題細(xì)胞和材料相容性問題細(xì)胞對材料表面要求材料生物安全性細(xì)胞起源安全性問題組織生長調(diào)控細(xì)胞在材料內(nèi)部功效性恢復(fù)臨床使用上面相容性問題新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第107頁良好生物材料要求1、生物相容性：組成和結(jié)構(gòu)與人體對應(yīng)組織相似，無免疫排異原性，良好生物相容性及組織相容性，能與宿主組織愈合，誘導(dǎo)再生性修復(fù)。2、生物力學(xué)順應(yīng)性：滿足應(yīng)用場所生物力學(xué)要求。3、生物降解性：能按需要降解，做到隨再生組織生長而作順應(yīng)性降解，使組織生長與材料降解同時。4、材料表面或者材質(zhì)能夠植入后，在原位誘導(dǎo)組織再生。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第108頁骨組織相容性檢測新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第109頁神經(jīng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用脊髓損傷缺血性腦卒中神經(jīng)元退行性病變，如ALS、帕金森病等新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第110頁胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用無限增殖、多向分化潛能當(dāng)前還存在較多問題，主要是在動物試驗階段。當(dāng)前關(guān)于胚胎干細(xì)胞治療相關(guān)動物模型試驗研究較多，如帕金森病等。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第111頁胚胎干細(xì)胞其它應(yīng)用建立胚胎干細(xì)胞體外分化模型建立各種基因改變胚胎干細(xì)胞系,以求發(fā)覺某些基因或細(xì)胞因子在胚胎發(fā)育早期對不一樣類型細(xì)胞或組織分化作用。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第112頁利用新生（Postnatal

day0）Nestin-GFP轉(zhuǎn) 基因小鼠研究證實多個臟器Nestin表示陽性新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第113頁SpermdevelopmentdefectofCDYLhomozygotesF新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第114頁藥品篩選平臺新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第115頁新藥在臨床使用前需要進(jìn)行一系列檢測和試驗,這些試驗都依靠動物來完成。不過動物模型試驗不可能完全反應(yīng)藥品對人體細(xì)胞作用。胚胎干細(xì)胞能模擬體內(nèi)細(xì)胞或組織對被檢測藥品反應(yīng),從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)藥物篩選模型。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第116頁干細(xì)胞凍存復(fù)蘇方案賽業(yè)（廣州）生物科技有限企業(yè)新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第117頁干細(xì)胞凍存原理在不加任何保護(hù)劑條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中水都會形成冰晶，能造成細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引發(fā)細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑，可使冰點降低。在遲緩凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下低溫中能降低冰晶形成。細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之快速經(jīng)過細(xì)胞最易受損-5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第118頁干細(xì)胞凍存液選擇選擇一個省時高效、安全穩(wěn)定凍存液，是做好細(xì)胞凍存關(guān)鍵！新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第119頁什么是NCR凍存液？Non-ControlRateNCR無控制速率就是降溫過程無需控制新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第120頁OriCellTMNCR凍存液研發(fā)機(jī)理

高山植物復(fù)活草耐過冰雪嚴(yán)寒仍能復(fù)活，某些昆蟲在高寒條件下能夠不凍死；都是因為其自身含有一些保護(hù)物質(zhì)，能在極端環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞不受損傷。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第121頁OriCellTMNCR凍存液研發(fā)機(jī)理Cyagen團(tuán)體模擬自然界這種神奇自我保護(hù)能力，在凍存液里添加了各種抗寒膜外保護(hù)劑、滲透性保護(hù)劑及沉降穩(wěn)定劑，使細(xì)胞在低溫環(huán)境下得到很好保護(hù)。新版干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)第122頁OriCellTMNCR凍存液作用機(jī)理細(xì)胞膜保護(hù)劑---可在細(xì)胞膜外瞬間形成一層保護(hù)膜，保護(hù)細(xì)胞不受細(xì)胞