凝膠過濾層析法分離血紅蛋白

凝膠過濾層析法分離血紅蛋白凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第1頁1.試驗?zāi)繕?biāo)初步了解凝膠過濾層析法簡單原理及應(yīng)用初步掌握應(yīng)用凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)

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2凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第2頁2.試驗原理層析法是利用混合物中各組分物理經(jīng)學(xué)性質(zhì)差異（如吸附力、溶解度、分子形狀、大小和極性等），使各組分以不一樣程度分布在兩相中，從而使各組分以不一樣速度隨流動相向前流動而到達(dá)分離目標(biāo)。層析法可分為各種類型，包含分配層析，離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析等。層析法分配層析離子交換層析凝膠過濾層析

親和層析

凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第3頁2.試驗原理1待分離混合物（A、B）隨流動相經(jīng)過固定相因為理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）能力不一樣，在兩相中分配（含量對比）不一樣與固定相相互作用力越弱組分，隨流動相移動時受到阻滯作用小，移動速度快分步搜集流出液，可得到樣品中所含各單一組分，從而到達(dá)將各組分分離目標(biāo)234凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第4頁凝膠過濾層析，主要依據(jù)混合物中分子大小及形狀不一樣，在經(jīng)過凝膠（固定相）時，分子擴散速率各異而到達(dá)分離目標(biāo)。凝膠顆粒含有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長而移動速率慢（阻滯作用大）；而大分子則被排除在外，沿凝膠間空隙隨（流動相）流動，流動短而移動速率快（阻滯作用?。刃》肿游镔|(zhì)先流出層析床，所以凝膠過濾層析又稱為排阻層析，分子篩層析，凝膠過濾法操作簡例，且操作條件溫和，不易引發(fā)生物樣品變性失活，分離效果好，故廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸分離提純（包含脫鹽、濃鹽及分子量測定等）2.試驗原理凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第5頁本試驗經(jīng)過sephadexG50層析柱，以蒸餾水為流動相，分離血紅蛋白（紅色，分子量約64,500）與二硝基氟苯-魚精蛋白（魚精蛋白與二硝基氟苯結(jié)合后為黃色，分子量為2,000-12,000）混合物，從顏色不一樣即可觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。2.試驗原理凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第6頁3.試驗用具試劑（1）交聯(lián)葡聚糖G-50（2）二硝基氟苯（3）魚精蛋白（4）0.9%NaCl（5）10%碳酸氫鈉（6）95%乙醇

儀器（1）錐形瓶（2）層析柱（1cm×25cm玻璃柱）（3）鐵架臺（4）彈簧夾（5）細(xì)橡皮管（長2cm）（6）量筒（7）小燒杯100ml凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第7頁4.操作步驟1、凝膠準(zhǔn)備：取sephadexG-503g置于錐形瓶中，加蒸餾水90ml，于沸水浴中煮沸2小時(或放于水中浸泡6小時)，充分膨脹凝膠。取出，冷卻至室溫后備用。2、裝柱：關(guān)閉下口，向玻璃柱內(nèi)加入蒸餾水達(dá)柱總長度約1/3處，把膨脹好糊狀凝膠邊攪拌、邊自柱頂端沿管內(nèi)壁緩緩加入柱中至柱頂部，待柱底部凝膠沉積至1-2cm時，開啟柱底部出水口，并控制一定流速，使柱中凝膠一直處于溶液中。再慢慢地繼續(xù)加入凝膠，直至凝膠體積至柱頂2.5cm左右，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。裝柱長度最少8cm。最終放入略小于層析柱內(nèi)徑圓形小濾紙片，以防未來加樣時凝膠被沖起。凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第8頁4.操作步驟3、平衡：用10ml左右蒸餾水流洗整個柱床。操作過程中嚴(yán)防出現(xiàn)氣泡和分層，如床面不平，可用玻璃棒輕輕攪動表面，是凝膠重新自然沉降。整個過程中勿使液面低于床面，以免氣體進(jìn)入，使柱床干裂。4、加樣：待柱床面以下蒸餾水流出，且剛好與床面相切時(切不可使床面完全暴露于空氣中)，關(guān)閉下口。用滴管取血紅蛋白及魚精蛋白混合液（血紅蛋白稀釋液3滴加DNP-魚精蛋白溶液3滴），十分小心地并緩緩沿內(nèi)壁加入(注意切勿破壞柱床面)，打開柱底部出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，至床面重新露出時，先加入少許蒸餾水，沖洗床面1-2次，然后再加入足量蒸餾水。凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第9頁4.操作步驟5、洗脫和標(biāo)定：用試管搜集洗脫液體。調(diào)整流速使液體均勻流出（約1ml/min），同時統(tǒng)計以下數(shù)據(jù)：起始、紅始、紅終、黃始、黃終、終止(1.5倍柱體積)。觀察血紅蛋白與魚精蛋白洗脫次序并統(tǒng)計試驗現(xiàn)象(注意洗脫過程中隨時添加蒸餾水，以免干柱)。6、清洗：待全部色帶流出層析柱后，繼續(xù)加入蒸餾水并加緊流速，清洗層析柱至凝膠潔凈呈白色為止。7、凝膠回收：將清洗潔凈sephadexG-50凝膠回收至回收容器中。8、結(jié)果處理：觀察統(tǒng)計試驗現(xiàn)象并加以分析。凝膠過濾層析法分離血紅蛋白第10頁5.注意事項膠膨脹必須徹底，不然會影響層析均一性，甚至有使柱破裂危險。裝柱前加入1cm洗脫液，檢驗柱子。凝膠裝柱過程中嚴(yán)防出現(xiàn)氣泡和分層，要使液面高于床面，以免氣體進(jìn)入柱床，影響液體在柱內(nèi)流動與最終血紅蛋白及核黃素混合物質(zhì)分離效果。凝膠裝柱要一次完成。裝凝膠燒杯不能清洗。（看似臟東西都是凝膠）。柱中凝膠一定要浸沒在洗脫液中。加樣一定要極其小心而遲緩，以免凝膠被沖起，造成層析結(jié)果不佳。上樣時滴管末端一定要靠近凝膠柱表面(1cm)、沿柱內(nèi)壁緩緩滴加，不能沖擊凝膠柱表面。樣品上柱后應(yīng)在凝膠柱表面形成一層薄液層。搜集要及時，不能等紅褐色物質(zhì)流出之后再搜集(13滴/管)。流速不可太快(約10滴/min)。層析前及