抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第1頁1、抗生素產(chǎn)生菌教材第一章、第一節(jié)：p1-19半數(shù)以上抗生素由放線菌產(chǎn)生，鏈霉菌，真菌與細菌?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第2頁真菌抗生素真菌抗生素主要是青霉和產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生青霉素，灰黃青霉產(chǎn)生灰黃霉素?；尹S霉素抗真菌（皮膚病與灰指甲?。?，對細菌無效。青霉素抗G+菌有效，對G-菌作用很弱，對人副作用小，有過敏反應?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第3頁青霉素是一類群化合物，不一樣青霉素側鏈R各異。常見青霉素G，R為苯甲基。低濃度抑菌，高濃度殺菌。有細菌產(chǎn)生青霉素酶，使酰胺環(huán)開裂而失去作用。細菌抗生素多是多肽類化合物。如短桿菌短桿菌素S，枯草芽孢桿菌枯草桿菌肽，多粘芽孢桿菌多粘菌素等，對動物有毒性，只限外用。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第4頁抗生素產(chǎn)生菌分離和篩選當前新抗生素取得路徑：

1、從自然界分離篩選新抗生素產(chǎn)生菌從土壤到海洋；到極端微生物；從微生物到植物、動物。2、改造現(xiàn)有已知抗生素產(chǎn)生菌，再經(jīng)篩選取得新得抗生素產(chǎn)生菌。3、從已知抗生素進行結構改造，經(jīng)篩選取得新半合成抗生素?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第5頁

4、采取新篩選方法

如：應用定向生物合成和突變生物合成原理，以及培養(yǎng)超敏細菌以尋找微量抗生素，選取新腫瘤模型來篩選抗腫瘤抗生素?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第6頁5、采取當代分子生物學技術產(chǎn)生新抗生素（1）基因克隆產(chǎn)生新抗生素：首先取得某已知抗生素結構基因，然后經(jīng)過一定載體將基因片段導入特定另一個抗生素產(chǎn)生菌中，則可能產(chǎn)生完全符合大家設計要求新抗生素。（2）緘默基因激活：引入抗生素生物合成調控基因，有可能激發(fā)抗生素產(chǎn)生菌處于休眠狀態(tài)或緘默狀態(tài)基因系統(tǒng)，從而開啟另一結構抗生素生物合成開關，得到新抗生素?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第7頁生產(chǎn)中常見菌種分離、選育和保藏

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第8頁一、菌種起源依據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購置；從大自然中分離篩選新微生物菌種?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第9頁二、分離思緒

新菌種分離是要從混雜各類微生物中依照生產(chǎn)要求、菌種特征，采取各種篩選方法，快速、準確地把所需要菌種挑選出來。試驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。有了優(yōu)良菌種，還要有適當工藝條件和合理先進設備與之配合?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第10頁定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種生長培養(yǎng)特征。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地經(jīng)過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特征包含形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特征、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選步驟抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第11頁

（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。普通園田土和耕作過沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內。采樣對象也能夠是植物，腐敗物品，一些水域等。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第12頁從自然界篩選抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第13頁2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多秋初為好。3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處土約10g，盛入清潔牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標識，統(tǒng)計采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物數(shù)量和類型盡少改變，宜將樣品逐步分批寄回，方便及時分離?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第14頁培養(yǎng)基組成標準大多數(shù)放線菌分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物瓊脂平板上進行。除嗜溫性放線菌外，其它放線菌普通在培養(yǎng)4-20天內在分離平板上遲緩形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，普通皆應在37℃培養(yǎng)箱中存放3天?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第15頁培養(yǎng)基選擇和配制標準營養(yǎng)吸收過程微生物營養(yǎng)活動是依靠外界分泌大量酶，將周圍環(huán)境中大分子蛋白質、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質分解成小分子化合物，借助于細胞膜滲透作用，吸收這些小分子營養(yǎng)物質來實現(xiàn)。培養(yǎng)基是提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要,按一定百分比配制各種營養(yǎng)物質混合物?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第16頁培養(yǎng)基選擇和配制標準培養(yǎng)基設計所要考慮問題為微生物生長繁殖、產(chǎn)物合成提供所需物質。工業(yè)發(fā)酵考慮原料價格問題。培養(yǎng)基設計共同特點碳源、氮源、無機元素、生長因子、水、氧氣抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第17頁一、培養(yǎng)基類型和用途據(jù)起源天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基主要成份或使用目標基礎培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、判別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基據(jù)生產(chǎn)工藝孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第18頁二、培養(yǎng)基選擇據(jù)微生物特點來選擇細菌、酵母菌、霉菌、放線菌據(jù)發(fā)酵方式選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基從生產(chǎn)實踐和科學試驗種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基從經(jīng)濟效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料價廉、起源豐富、運輸方便抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第19頁三、培養(yǎng)基配制標準據(jù)不一樣微生物營養(yǎng)需要配制不一樣培養(yǎng)基營養(yǎng)成份恰當配比C/N滲透壓PH抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第20頁四、培養(yǎng)基成份配比選擇參考前人所使用某一類菌種培養(yǎng)基經(jīng)驗配方結合菌種和產(chǎn)品特征確定初始配方對碳源、氮、無機鹽、前體等種類和量進行逐一單因子試驗觀察對菌體生長、產(chǎn)物合成影響綜合考慮各種原因，得到適合菌種配方對其結果加以驗證最終確認最正確配方抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第21頁四、培養(yǎng)基成份配比選擇對代謝路徑清楚主要代謝產(chǎn)物，能夠依據(jù)物料平衡加以確定如：青霉素發(fā)酵抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第22頁微生物所需要物質碳源、氮源、無機元素、生長因子、水、氧氣在發(fā)酵工業(yè)中、必須使用廉價原料來配制培養(yǎng)基，而且盡可能滿足以下要求消耗每克底物將產(chǎn)生最大菌體得率或產(chǎn)物得率能產(chǎn)生最高產(chǎn)品或菌體濃度能得到產(chǎn)物最大速率副產(chǎn)品得率最小價廉而且有穩(wěn)定質量起源豐富且供給充分通氣和攪拌、提純、廢物處理等生產(chǎn)工藝較輕易另外培養(yǎng)基選擇還會影響發(fā)酵罐設計抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第23頁（1）糖（2）脂肪（3）醇、有機酸（4）碳氫化合物

除此之外，酒精、有機酸、烷烴等含碳物質越來越引發(fā)大家重視。

供給菌體生命活動所需要能量和組成菌體細胞以及代謝產(chǎn)物基礎碳源抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第24頁（1）無機：氨水、銨鹽、硝酸鹽（2）有機：玉米漿、豆餅粉、花生餅粉

氮源抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第25頁

組成菌體成份、作為酶組成個別，酶激活劑、抑制劑、調整滲透壓、調整ph，氧化還原電位磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物、鉀、鈉、鎂、鐵、銅、錳、鉬、碘、溴特點：需要量少，但作用重大無機鹽抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第26頁微生物生長不可缺乏微量有機物質：組成細胞組分、促進生命活動進行。（1）生物素（2）VB2（3）提供生長因子農(nóng)副產(chǎn)品原料：玉米漿、麩皮水解液、酵母膏

生長因子抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第27頁

與菌種特征和生物合成產(chǎn)物代謝控制相關，但并不促進菌體生長。（1）前體物質一些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產(chǎn)物分子中去，而其本身結構并沒有多大改變，但產(chǎn)物量卻因加入而有較大提升。如：氨基酸、核苷酸、抗生素（2）促進劑、抑制劑如：誘導物、表面活性劑前體物質和促進劑抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第28頁

作用：促進生長發(fā)育推遲菌體自溶抑制了無用代謝路徑改變發(fā)酵液物理性質、改進通氣量促進產(chǎn)物合成抑制雜菌前體物質和促進劑抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第29頁放線菌分離土樣中放線菌非選擇性分離：土樣風干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌分離：無菌取植物組織，干燥以降低細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌分離：為使所要分離放線菌數(shù)量種類增多，普通將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第30頁次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可依據(jù)肉眼可見菌落形態(tài)上差異，作初步判定和區(qū)分。經(jīng)過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不一樣放線菌屬及種關鍵是所采集樣本本身及其分離用瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不一樣生長形態(tài)、從而初步地加以判定，在分離放線菌時顯得尤為主要。將分離平板上所形成菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以深入篩選和分離?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第31頁帶圖象分析系統(tǒng)微生物菌種

顯微觀察裝置

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第32頁篩選：是指從大量待篩選微生物中，盡快地判別出有實用價值抗生素產(chǎn)生菌試驗過程。

1、篩選模型：是指篩選工作中所使用試驗菌。為了防止感染病原菌危險，盡可能選取非致病、且能代表一些類型致病菌微生物作為試驗菌。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第33頁常見試驗菌和代表致病微生物

試驗菌代表致病微生物

金黃色葡萄球菌革蘭陽性球菌枯草芽孢桿菌革蘭陽性桿菌恥垢分支桿菌結核分枝桿菌大腸埃希菌革蘭陰性桿菌白假絲酵母菌酵母狀真菌曲霉絲狀真菌噬菌體病毒、腫瘤細胞抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第34頁篩選方法

抗菌抗生素普通采取瓊脂擴散法。

先制備含試驗菌平板，然后以無菌濾紙片蘸取各放線菌搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液或切取一定大小放線菌瓊脂培養(yǎng)塊，置于含菌平板上，培養(yǎng)后觀察有沒有抑菌圈產(chǎn)生。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第35頁微生物群體生長規(guī)律生長曲線代表在新適應環(huán)境中生長、分裂直至衰老、死亡全過程動態(tài)改變規(guī)律。分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定時和死亡期四個主要時期。生長曲線不一樣時期反應是群體而不是單個細胞生長規(guī)律。認識和掌握微生物生長曲線有主要實踐意義。如設法縮短遲緩期、延長對數(shù)期以及在穩(wěn)定時搜集菌體?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第36頁無分支單細胞微生物群體生長曲線抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第37頁1.遲緩期（1）主要特征：代謝活躍，大量合成細胞分裂所需酶類、ATP等；體積增大；分裂遲緩。（2）原因：在新環(huán)境，缺乏分解或催化相關底物酶。（3）縮短和消除遲緩期方法有：增加接種量、采取最適種齡、選取繁殖速度快菌種以及盡可能保持接種前后所處培養(yǎng)基介質和條件一致?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第38頁2.對數(shù)期（1）特點：分裂速度最快、代時最短、代謝活動旺盛、對環(huán)境改變敏感。（2）作用：作為代謝、生理等研究好材料和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子最正確菌齡?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第39頁3.穩(wěn)定時（1）特點：新生細胞和死亡細胞數(shù)目相等、總菌數(shù)到達最大值、代謝活力鈍化。（2）原因：營養(yǎng)物質逐步消耗以及代謝廢物積累抑制了生長。（3）功效：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定時研究發(fā)展了連續(xù)培養(yǎng)技術?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第40頁4.死亡期

特點：活細胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細胞裂解或自溶。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第41頁絲狀微生物群體生長1.特征：絲狀生長和沉淀生長兩種方式。2.絲狀微生物生長以單位時間內微生物物質量改變來表示。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第42頁抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第43頁三、連續(xù)培養(yǎng)（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)1.概念：

分批培養(yǎng)：指將微生物置于一定容積培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最終一次收獲培養(yǎng)方式。

連續(xù)培養(yǎng)：在一個恒定容積流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，首先以一定速率不停地加入新培養(yǎng)基，另首先又以相同速率流出培養(yǎng)物(菌體和代謝產(chǎn)物)，以使培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持穩(wěn)定?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第44頁2.連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)類型

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第45頁環(huán)境原因對微生物生長影響一、溫度抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第46頁

溫度太低：使原生質膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進行營養(yǎng)物質運輸或形成質子梯度。溫度太高：蛋白質、核酸和細胞其它組成發(fā)生不可逆變形作用。

最低生長溫度三種基礎溫度最適生長溫度最高生長溫度抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第47頁依據(jù)生長溫度分類：

1.嗜冷微生物2.嗜溫微生物

3.嗜熱微生物4.嗜高熱微生物抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第48頁1.嗜冷微生物能夠在低溫條件下生長原因是：其所含酶在低溫能有效地催化生化反應；在低溫下主動運輸仍能正常進行，有效吸收必須營養(yǎng)物質，是其原生質膜中含有較多不飽和脂肪酸，在低溫下仍可維持膜流動性。2.嗜高溫微生物在高溫條件下生長原因是：其酶和其它蛋白質在高溫時更穩(wěn)定；其蛋白質合成機構和細胞質膜（富含飽和脂肪酸等）等結組成份是熱穩(wěn)定?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第49頁3.微生物耐熱性在實踐中主要性：發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)點是發(fā)酵周期短，效率高；有利于非氣體物質在發(fā)酵液中擴散和溶解，以及預防雜菌污染；可節(jié)約冷卻發(fā)酵熱量所需成本?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第50頁二、pH1.pH影響微生物生長原因：介質pH影響生活環(huán)境中營養(yǎng)物質可給態(tài)和有毒物質毒性；影響菌體細胞膜帶電荷性質、膜穩(wěn)定性及膜對物質吸收能力；使菌體表面蛋白變性或水解。

2.分類：嗜酸性微生物（<pH5.4）嗜中性微生物（pH5.4～pH8.5）嗜堿性微生物（pH7.0～pH11.5）抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第51頁3.嗜酸或嗜堿微生物耐酸或耐堿原因：主要是因為細胞本身含有維持胞內pH值靠近中性能力。嗜酸微生物在酸性環(huán)境中，細胞膜能夠阻止H＋進入胞內、不停將胞內H＋排出胞外。而嗜堿或耐堿微生物，則能夠阻止OH-進人胞內并將其排出胞外，以維持胞內靠近中性pH?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第52頁工業(yè)菌種育種方針工業(yè)菌種育種：是利用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目標菌株進行多方位改造。經(jīng)過改造，可使現(xiàn)存優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質或增加新性狀?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第53頁工業(yè)菌種育種方法誘變基因轉移基因重組抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第54頁育種過程包含以下3個步驟：

(1)在不影響菌種活力前提下，有益基因型引入。(2)希望基因型選出。(3)改良菌種評價(包含試驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第55頁選擇育種方法時綜合考慮原因

(1)待改良性狀本質及與發(fā)酵工藝關系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)；

(2)對這一特定菌種遺傳和生物化學萬面認識明了程度；

(3)經(jīng)濟費用。假如對特定菌種基礎性狀及其工藝知曉甚少，則多半采取隨機誘變、篩選及選育等技術：假如對其遺傳及生物化學方面性狀已經(jīng)有較深認識，則可選擇基因重組等伎倆進行定向育種?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第56頁工業(yè)菌種改良方法(1)解除或繞過代謝路徑中限速步驟：經(jīng)過增加特定基因拷貝數(shù)或增加對應基因表示能力來提升限速酶含量；在代謝路徑中引伸出新代謝步驟，由此提供一個旁路代謝路徑。

(2)增加前體物濃度。

(3)改變代謝路徑，降低無用副產(chǎn)品生成以及提升菌種對高濃度有潛在毒性底物、前體或產(chǎn)品耐受力?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第57頁(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進菌種外泌產(chǎn)品能力。(6)消除代謝產(chǎn)品反饋抑制。如誘導代謝產(chǎn)品結構類似物抗性?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第58頁

提升特定基因表示水平(1)引入強轉錄及翻譯信號，可經(jīng)過在一高效表示載體上克隆靶基因；在靶基因上游引入強開啟子；修改現(xiàn)有表示信號，提升基因效力等。(2)誘導解除基因表示抑制突變?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第59頁

改進菌種生長期有效率提升菌株對底物利用率方法：

a.經(jīng)過確定并改變代謝中耗能個別;b.由另一菌株高效低能代謝路徑代謝來實現(xiàn)。

c.賦予菌種對各種底物，尤其是價廉而豐富底物利用能力，由此可降低操作費用。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第60頁誘變育種以微生物自然變異作為基礎生產(chǎn)選種機率并不很高，一個基因自然突變頻率僅10-6-10-10左右。誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A育種，是迄今為止我國外提升菌種產(chǎn)量、性能主要伎倆?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第61頁誘變物理、化學或生物誘變方法抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第62頁

一、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；物理原因中當前使用得最方便而且十分有效是紫外線。許多高產(chǎn)菌株選育都用過紫外線，對于普通試驗室、中小型工廠都適用，也很安全。其它幾個射線都是電離性質，有一定穿透力，普通都由專業(yè)人員在專門設備中使用，不然有一定危險性?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第63頁化學誘變劑：化學因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W誘變劑中使用最多、最有效是烷化劑。使用化學誘變劑優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第64頁2、化學誘變劑是很經(jīng)濟，因為只需要少許適當誘變劑，設備是試驗室普通玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射工作時，設備費用大，并要注意安全性。3、大個別誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常慎重，要防止化學誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有些人對一些誘變劑極其敏感，甚至未直接接觸就會過敏，這就更要當心。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第65頁誘變劑選擇1．堿基類似物和羥胺含有很高特異性，但極少使用，回復突變率高，效果不大。2．亞硝酸和烷化劑應用范圍較廣，造成遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小誘變劑之一?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第66頁3．吖啶類誘變劑能夠造成生化代謝路徑完全中止。4．紫外線十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷最好誘變劑，它能造成不可回復缺突變。但它可能影響鄰近基因性能?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第67頁二、誘變育種步驟出發(fā)菌株選擇處理菌懸液制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第68頁(一)出發(fā)菌株選擇1．自然界新分離野生型菌株，對誘變處理較敏感，輕易到達好效果。2．在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到菌株與野生型較相像，也是良好出發(fā)菌株。3．每次誘變處理都有一定提升菌株，往往屢次誘變能積累較多提升。4．出發(fā)菌株開始時能夠同時選2～3株，在處理比較后，將更適合出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第69頁5．要盡可能選擇單倍體細胞、單核或核少多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是因為變異性狀大個別是隱性，尤其是高產(chǎn)基因。

6．依據(jù)采取誘變劑或依據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑重復處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期細胞：有作用于休止期，就可選取孢子。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第70頁

(二)處理菌懸液制備這一步驟關鍵是制備單細胞和單孢子狀態(tài)、活力類似菌懸液，為此要進行適當培養(yǎng)基培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第71頁(三)誘變處理

依據(jù)前面相關誘變劑及誘變處理介紹，結合誘變對象實際，設計誘變處理方案?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第72頁

(四)中間培養(yǎng)

因為在發(fā)生了突變還未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲過程，即細胞內原有酶量稀釋過程(生理延遲)，需3代以上繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后篩選和取得穩(wěn)定菌株都是極為主要。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第73頁

方法：讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞遺傳物質復制，讓細胞繁殖幾代，以得到純變異細胞。這么，隱性變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結果不穩(wěn)定和未來菌株退化?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第74頁(五)分離和篩選篩選分初篩和復篩。初篩以快速篩出大量到達初步要求分離菌落為目標，以量為主。復篩則是精選，以質為主，也就是以準確度為主。所以在詳細方法上就有差異.

比如初篩能夠在平皿上直接以菌落代謝產(chǎn)物與一些染料或基質作用形成變色圈或透明圈大小來挑取參加復篩者，而將90%菌落淘汰。在數(shù)量降低后就要仔細比較參加復篩和再復篩菌株，最終才能選得優(yōu)異菌株。在以后復篩階段，還應不停結合自然分離，純化菌株。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第75頁紫外線誘變育種

紫外線誘變普通采取15W紫外線殺菌燈，燈與處理物距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，普通為幾秒至幾十分鐘。普通咱們常以細胞死亡率表示，希望照射劑量死亡率控制在70～80%為宜?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第76頁

被照射菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106～107個／ml。因為紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。因為紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后處理應在紅燈下進行?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第77頁(二)操作步驟

1．將細菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一巳滅菌，裝有玻璃珠三角瓶內用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙漏斗內過濾，單細胞濾液裝入試管內，普通處于渾濁態(tài)細胞液含細胞數(shù)可達108個／ml左右，作為待處理菌懸液。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第78頁3．取2～4m1制備菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應先開紫外線10min，讓紫外燈預熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應在紅燈下進行，或用黑紙包住，防止白熾光?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第79頁

4．取未照射制備菌液和照射菌液各0.5ml進行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。

5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。

6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。

7．挑取菌落進行篩選?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第80頁亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈誘變作用。其準確作用機制尚不很清楚，據(jù)認為是伴伴隨重氮甲烷生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內DNA復制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG誘變作用隨pH升高而增強。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第81頁(二)操作步驟

1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，馬上經(jīng)過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達l06個／ml，此為待處理孢子懸液。

2．MNNG溶液制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第82頁3．誘變處理吸收MNNG溶液lml，加入到1ml孢子懸液中，30℃振蕩30min，馬上稀釋1000倍停頓作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計數(shù)。

4．死亡率計算將未處理孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐層稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。依據(jù)處理前后活孢子數(shù)可計算出死亡率。

5．挑取菌落進行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第83頁營養(yǎng)缺點型選育營養(yǎng)缺點型是指經(jīng)過誘變而產(chǎn)生缺乏合成一些營養(yǎng)物質如氨基酸、維生素和堿基等能力，必須在其基礎培養(yǎng)基中加入對應營養(yǎng)成份才能正常生長變異株。與營養(yǎng)缺點型對應是野生型?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第84頁能滿足野生型菌株正常生長培養(yǎng)基稱基礎培養(yǎng)基(MM)；在基礎培養(yǎng)基中加入對應營養(yǎng)成份稱補充培養(yǎng)基(SM)；能滿足各種營養(yǎng)缺點型生長稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第85頁營養(yǎng)缺點型用途

營養(yǎng)缺點型在生產(chǎn)上和科學研究上用途很大。當前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸菌種都是各種類型缺點型。要研究代謝路徑，育種技術都必須有營養(yǎng)缺點型菌株為材料?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第86頁篩選營養(yǎng)缺點型步驟誘變淘汰野生型檢出缺點型確定生長譜抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第87頁一、誘變方法物理誘變化學誘變抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第88頁二、淘汰野生型抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺點型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺點型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。因為細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就對應加入一定量抗生素，結果活化狀態(tài)野生型就被殺死，保留了缺點型。普通細菌能夠采取青霉素，酵母可采取制霉菌素。菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺點型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第89頁

三、檢出缺點型原理：在固體基礎培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不一樣，缺點型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。詳細方法：影印法、點種法、夾層法抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第90頁1．將一較平皿直徑小1cm金屬圓筒蒙上一層滅菌絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。2．將完全培養(yǎng)基上長出全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標識方位。3．將基礎培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標識同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復印于上。

(一)影印法抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第91頁4．將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。5．二平皿相同方位進行比較，即可發(fā)覺在MM平皿上長出菌落少于GM平板上。MM上未長而對應于CM上長出那幾個菌落就可能是缺點型。此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應有一定間隔?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第92頁

(二)點種法也就是任意法。用接種針或牙簽將CM上長出菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在對應位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。此法結果明確，但工作量大?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第93頁

(三)夾層法先在培養(yǎng)皿上倒一層基礎瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)菌落標識，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出菌落就可能是缺點型。此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺點型菌落從夾層中挑出并不很輕易。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第94頁四、營養(yǎng)缺點型生長譜確實定

驗證確定是缺點型后，就需確定其缺點因子，即生長譜測定?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第95頁生長譜測定方法將缺點型菌株培養(yǎng)后，搜集菌體，制備成細胞懸液，與MM培養(yǎng)基(融化并涼至50℃)混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿5～6個區(qū)間放上不一樣營養(yǎng)組合混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物濾紙圓片。培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。1個平皿測一個菌。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第96頁以不一樣組合營養(yǎng)混合物與融化涼至50℃MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺點型菌株于各對應位置，培養(yǎng)后依據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子。在5～6個平皿上可測20株菌以上?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第97頁基因育種基因重組育種：是利用體外DNA各種操作或修改手法取得目標基因，再借助于病毒、細菌質?；蚱渌d體，將目標基因轉移至新宿主細胞并使其在新宿主細胞系統(tǒng)內進行復制和表示，或者經(jīng)過細胞間相互作用，使1個細胞優(yōu)異性狀經(jīng)其間遺傳物質交換而轉移給另1個細胞方法?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第98頁一個完整基因克隆過程包含以下步驟１、取得待克隆DNA片段（基因）；２、目標基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導入宿主細胞；４、篩選、判定陽性重組子；５、重組子擴增與／或表示。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第99頁2.2基因重組抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第100頁一、質粒特點1、質粒存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在質粒數(shù)稱為該質粒拷貝數(shù)。不一樣類型質粒其拷貝數(shù)各異，同一質粒在不一樣條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質粒DNA分子常展現(xiàn)三種形態(tài)；常見一個是共價、閉環(huán)狀DNA(CCCDNA)；其次是因為1條鏈有缺口而產(chǎn)生開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生線性DNA?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第101頁質粒載體抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第102頁二、各類質粒所賦予宿主細胞不一樣表現(xiàn)型

抗生素抗性：抗生素產(chǎn)生；大腸桿菌素產(chǎn)生；腸毒素產(chǎn)生；復雜有機化合物降解；限制性核酸內切酶和修飾酶產(chǎn)生；殺傷性能。在自然條件下，許多質?？山?jīng)細菌接合或相同方式在宿主間相互轉移。在試驗室條件下，質粒也可經(jīng)人工伎倆將其轉化入宿主細胞內。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第103頁三、質粒DNA提取方法細菌培養(yǎng)和質粒擴增；細菌收獲和裂解；質粒DNA提取?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第104頁四、遺傳轉化

轉化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離DNA片段，將其同源個別進行堿基配對，組合到自己基因中，從而取得供體細胞一些遺傳性狀?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第105頁(二)操作步驟：質粒DNA轉化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入10ml肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。2．取0.5ml培養(yǎng)物接入50ml肉湯中，無菌添加0.4ml2.5mol／LMgCl2，于37℃振蕩培養(yǎng)。3．將0.1mol／LCaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第106頁4．當培養(yǎng)物A600在0.5～0.8左右時，開始收獲細胞(大約需2～2.5h)．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻10min。6．取10ml培養(yǎng)物置2個冷離心管中棄去上清液?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第107頁7．加入1ml0.1mol／LCaCl2，再加0.9mlCaCl2，置冰浴中放置20min。8．3000r／min離心10min，棄去上清液．9．加入1ml0.1mol／LCaCl2，重新懸浮細胞，置冰浴中保留。10．加入1～20μl待轉化質粒DNA溶液?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第108頁11．在冰上放置20min，在37℃處理2min。再插入冰中，加入0.9m1肉湯37℃靜置培養(yǎng)90min。12．以不一樣量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于37℃培養(yǎng)過夜。判定轉化菌落?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第109頁常見遺傳轉化系統(tǒng)1、自然系統(tǒng)2、人工誘導（完整細胞）（1）二價陽離子系統(tǒng)：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++輔助噬菌體，Tris+Ca2+（2）單價陽離子系統(tǒng)：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）凍融系統(tǒng)（4）Triton處理：人工誘導（PEG/原生質體）抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第110頁重組DNA中常見工具酶包含限制性核酸內切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉錄酶等?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第111頁限制性內切酶切開DNA分子所需酶：每一個酶都有其各自作用位點。常見限制性內切酶種類及特征W.Arber,H.O.Smith抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第112頁限制性內切酶剪切方式抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第113頁粘性未端：切開后兩段DNA各留下一個尾，這2個尾核苷酸次序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補，在適當條件下能夠再連接一起?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第114頁其它工具酶連接酶T4DNA修補工具酶DNA聚合酶I末端加工酶S1核酸酶，堿性磷酸單脂酶末端轉移酶人工加polyA或polyT尾反轉錄酶抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第115頁載體－宿主系統(tǒng)載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表示DNA；普通是經(jīng)過改造質粒、噬菌體或病毒等構建。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第116頁載體應具備以下條件：１、能在適當宿主細胞中復制；２、含有各種限制酶單一切點（即所謂多克隆位點）方便外源DNA插入；３、含有篩選標志以區(qū)分陽性與陰性重組分子；４、載體分子較小，方便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離；５、對于表示型載體還應含有與宿主細胞相適應開啟子、增強子、加尾信號等基因表示元件。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第117頁宿主細胞必須符合以下條件１、對載體復制和擴增沒有嚴格限制；２、不存在特異內切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾；４、重組缺點型，不會產(chǎn)生體內重組；５、輕易導入重組DNA分子；６、符合重組DNA操作安全標準。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第118頁目標基因獲取一、經(jīng)過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包含兩類：基因組文庫：利用限制性內切酶。cDNA：用mRNA反轉錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐硎緝群?。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第119頁二、化學合成法制備DNA片段從蛋白質肽鏈氨基酸次序能夠知道它遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段對于已知全部或個別核苷酸序列基因，能夠經(jīng)過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目標基因片段。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第120頁PCR技術依據(jù)需擴增片段兩端設計引物。使DNA解鏈（高溫），引物結合于基因兩端（低溫），在適當溫度下開始合成（鏈延長）反應。特點：需要極少DNA模板，且能直接從基因組中得到目標基因?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第121頁DNA擴增PCR反應抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第122頁DNA片斷克隆載體條件a復制起點b適宜限制酶切點c選擇標識抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第123頁

DNA分子體外連接

DNA片段體外連接是重組DNA技術關鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第124頁一、DNA連接酶DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體DNA連接酶。T4DNA連接酶在分子克隆中主要用于：１、連接含有同源互補粘性末端ＤＮＡ片段；２、連接雙鏈DNA分子間平端；３、在雙鏈平端DNA分子上添加合成人工接頭或適配子?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第125頁重組DNA導入宿主菌

體外連接重組DNA分子必須導入適當受體細胞中才能大量復制、增殖和表示。依據(jù)所采取載體性質，將重組DNA分子導入受體可有不一樣方法?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第126頁一、轉化指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞過程。轉化時，細菌必須經(jīng)過適當處理使之處于感受態(tài)－即輕易接收外源DNA狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導入細菌宿主中。另外還可用電穿孔法轉化細菌，它優(yōu)點是操作簡便、轉化效率高、適合用于任何菌株。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第127頁二、轉染和感染

利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導入受體菌。一個是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一個方式是轉染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質粒一樣地轉化進受體菌。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成重組子導入細胞過程統(tǒng)稱為轉染?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第128頁重組克隆篩選與判定

基因克隆最終一步是從轉化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子菌落，并判定重組子正確性。經(jīng)過細菌培養(yǎng)以及重組子擴增，取得所需基因片段大量拷貝。深入研究該基因結構、功效，或表示該基因產(chǎn)物?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第129頁一、抗藥性標志篩選

假如克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetr，轉化后只有含這種抗藥基因轉化子細菌才能在含該抗菌素平板上幸存并形成菌落，這么就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)分開來。假如重組DNA時將外源基因插入標志基因內，該標志基因失活，經(jīng)過有沒有抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）轉化菌落?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第130頁二、β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選

很多載體都攜帶一段細菌lacZ基因，它編碼β－半乳糖苷酶N-端146個氨基酸，稱為α－肽，它表示β－半乳糖苷酶C-端肽鏈。當載體與宿主細胞同時表示兩個片段時，宿主細胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特異底物X-gal變?yōu)樘m色化合物，這就是所謂α－互補。而重組子因為基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互補，在含X-gal平板上，含陽性重組子細菌為無色菌落或噬菌斑?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第131頁三、菌落快速裂解判定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質粒大小，判斷有沒有插入片段存在，該法適于插入片段較大重組子初篩。四、內切酶圖譜判定經(jīng)初篩判定有重組子菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質?；蛑亟M噬菌體DNA，用對應內切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入重組子，還要用內切酶消化判定插入方向?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第132頁重組DNA判定遺傳學方法抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第133頁雜交育種抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第134頁

(一)細菌雜交在細菌中實現(xiàn)雜交種類尚不多，主要是大腸桿菌，其它還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質一定位置上(Hfr細胞)。F因子有顯著感染性，大腸桿菌接合，實質上是F因子轉移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第135頁（二）酵母雜交育種技術1、酵母繁殖方式酵母為單細胞型真菌，普通以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件誘導，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第136頁單倍體細胞具α及ε2兩種交配型。兩種交配型細胞經(jīng)其細胞壁上特定凝聚因子誘導而進行交配，恢復為雙倍體；同一交配型細胞之間，則因細胞壁上凝集因子存在而不能進行交配。在生活過程中，酵母細胞還能夠形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細胞?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第137頁2、酵母雜交普通而言，雜交育種利用了酵母單雙倍生活周期，將不一樣基因型和相正確交配型單倍體細胞經(jīng)誘導雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可取得新遺傳性狀。酵母雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，利用罕見交配法更易取得結果?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第138頁原生質體育種

原生質體育種技術主要有原生質體融合、原生質體轉化技術，另外還有原生質體誘變育種等。原生質休融合育種是基因重組一個主要方法。原生質體融合作為一個新基因重組伎倆是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出來。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第139頁

一、原生質體融合育種特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形原生質體。(二)受接合型或致育型限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體作用，所以有利于不一樣種屬間微生物雜交。(三)遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株細胞質和細胞核進行類似合二為一過程?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第140頁

(四)存在著兩株以上親株同時參加融合形成融合子可能性。（五有可能采取產(chǎn)量性狀較高菌株作融合親株。

(六)提升菌株產(chǎn)量潛力較大。

(七)有利于建立工業(yè)微生物轉化體系。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第141頁二、原生質體融合育種步驟1．標識菌株篩選和穩(wěn)定性驗證。2．原生質體制備。3．等量原生質體加聚乙二醇促進融合。4．涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子深入試驗、保藏。6．生產(chǎn)性能篩選?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第142頁

三、原生質體融合育種關鍵點（一）標識菌種選擇取得標識菌種方法是采取常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺點型或／和抗藥性菌株。這里最主要是標識必須穩(wěn)定。采取抗藥性菌株除可作標識外，在試驗室中還可排除雜菌污染干擾。為是確證融合成功，能夠采取多標識菌種?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第143頁

(二)原生質體制備

原生質體制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結果剩下由原生質膜包住類似球狀細胞，它保持原細胞一切活性。在放線菌和細菌中，制備原生質體主要采取溶菌酶；酵母和霉菌普通可用蝸牛酶或纖維素酶等?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第144頁

影響原生質體制備原因1．菌體前處理為了使酶作用效果好一些，可將菌作一些前處理。如細菌加入亞抑制劑量青霉素。2．菌體培養(yǎng)時間為了使細胞易于原生質體化，普通選擇增殖期菌體。3．酶濃度對于不一樣種屬微生物，不但對酶種類要求不一樣，就是對酶濃度也有差異。另外，最正確酶濃度還隨不一樣生長久菌體而改變?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第145頁4．酶處理溫度5．破壁時pH值6．滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質體制備中，不但起到保護原生質體免于膨裂，而且還有利于酶和底物結合，滲透壓穩(wěn)定劑多采取甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機物和KCl和NaCl等無機物?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第146頁篩選新代謝產(chǎn)物

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第147頁一、開發(fā)新代謝產(chǎn)物路徑

(1)從自然界分離新微生物菌株，或采取新檢閱方法篩選新代謝產(chǎn)物。(2)對已知微生物代謝產(chǎn)物進行化學修飾。(3)利用微生物轉化改造代謝產(chǎn)物結構。(4)經(jīng)過原生質體融合取得新代謝產(chǎn)物。(5)DNA重組技術?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第148頁二、篩選微生物新代謝產(chǎn)物

程序

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第149頁抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第150頁突變型菌株篩選

一、產(chǎn)量性狀突變株篩選抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第151頁

三、篩選微生物代謝產(chǎn)物目標

篩選克服抗生素抗性菌株活性物質；篩選抗腫瘤、抗病毒活性物質；研究有藥理活性酶抑制劑及免疫調整劑；尋找食品工業(yè)最好酵母培養(yǎng)物；篩選降解有害物質微生物以及治療上含有低毒、長期有效化學藥品等。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第152頁四、篩選微生物代謝產(chǎn)物方法

(一)直接方法為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物利用前途，在體外試驗測得活性后，能夠將培養(yǎng)液有效成份直接作用于機體，觀察被測樣品療效。這種直接確定代謝產(chǎn)物用途方法亦稱動物體內治療試驗?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第153頁抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第154頁

(二)間接方法篩選醫(yī)用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質。在預篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。經(jīng)過預篩選，直接測定最初分離物生物活性，能加速篩選過程。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第155頁

五、檢測系統(tǒng)

篩選過程成功依賴于排除那些已知或并非需要代謝產(chǎn)物檢驗方法，這么才能識別出大家需要化合物?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第156頁性能簽別

性能判別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎工作。判別可分為兩方面：一是對微生物方面進行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功效答試驗觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌類群；

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第157頁

二是從化學早期判別來判別微生物代謝產(chǎn)物?；瘜W早期判別普通對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生代謝產(chǎn)物進行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井取得各種圖譜，與已知圖譜進行比較判別。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第158頁假如認為是有實用前途代謝產(chǎn)物，則要深入大量培養(yǎng)，并進行動物試驗、毒性考查、藥品代謝等試驗，并進行提升發(fā)酵水平和改進提取工藝工作，以備投入生產(chǎn)。假如是新代謝產(chǎn)物．普通要深入確定其化學結構，井在此基礎上進行合成法研究或進行化學改造，研究結構與生物活性相互關系，并對作用機制、生物合成過程作深入研究?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第159頁

菌種篩選方法

誘變處理后，突變細胞只占存活細胞百分之幾，而能使生產(chǎn)情況提升細胞又只是突變細胞中少數(shù)。

為了花費最少工作量，在最短時間內取得最大篩選成效，就要求采取效率較高科學篩選方案和伎倆?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第160頁菌種篩選方案

初篩：目標是刪去明確不符合要求大個別菌株，把生產(chǎn)性狀類似菌株盡可能保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定準確性還在其次。初篩伎倆應盡可能快速、簡單。復篩目標是確認符合生產(chǎn)要求菌株，所以，復篩步驟以質為主，應準確測定每個菌株生產(chǎn)指標?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第161頁菌種篩選伎倆

初篩從菌體形態(tài)變異分析平皿快速檢測法

詳細有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。

初篩搖瓶培養(yǎng)普通是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%很好菌株，淘汰80-90%菌株；而復篩中搖瓶培養(yǎng)普通是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個很好菌株，再做深入比較，選出最正確菌株?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第162頁特殊變異菌篩選方法

營養(yǎng)缺點型突變株篩選

經(jīng)誘變處理后菌懸液在篩選前普通應先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，預防出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純菌株。營養(yǎng)缺點型篩選普通包含濃縮、深入檢出和判別營養(yǎng)缺點型等步驟。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第163頁抗性突變菌株篩選

抗性突變株篩選相對比較輕易，只要有10-6頻率突變體存在，就輕易篩選出來?？剐酝蛔冎旰Y選常見有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種伎倆?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第164頁

一次性篩選法

噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株階梯性篩選法藥品抗性突變株?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第165頁組成酶變異株篩選

許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶生產(chǎn)不但需要誘導物，而且受到誘導物種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物影響。詳細篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導抑制物法?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第166頁1)

恒化器法：常被用于微生物“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導作用低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成相關酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提升組成酶變異株優(yōu)勢，即它在群體中百分比，能夠應用恒化器培養(yǎng)技術。伴隨恒化器培養(yǎng)中不停加入新鮮基質而逐步增大組成酶變異株優(yōu)勢，這么就能夠比較輕易地做深入純化分離。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第167頁2)

循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導物培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導物培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當接種到不含誘導物而含有其它可利用碳源培養(yǎng)基中時，兩種類型菌株一樣能很好地生長，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成相關水解酶，而誘導型菌株就不能合成。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第168頁

將它們轉接入含誘導物培養(yǎng)基中時，變異株能快速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導合成酶階段，兩類菌株生長就不一樣時，組成酶變異株所占百分比將逐步增大。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第169頁3)

誘導抑制劑法：有些化合物能阻止一些誘導酶合成，當在誘導物和誘導抑制劑同時存在培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時，誘導型菌株不能產(chǎn)生誘導酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第170頁工業(yè)微生物菌種保藏技術

在生產(chǎn)發(fā)酵中，含有高產(chǎn)有主要經(jīng)濟價值某一期待代謝產(chǎn)物主能力微生物菌種保留和長久保藏，對于一成功工業(yè)發(fā)酵過程極為主要?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第171頁一、理想菌種保藏方法應具備條件(1)

經(jīng)長久保藏后菌種存活健在；(2)

確保高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，尤其是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏基礎辦法是低溫、干燥、真空?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第172頁二、工業(yè)微生物菌種保藏技術

(1)冷凍干燥或真空干燥保藏；

(2)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(3)

轉接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?/p>

(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第173頁2.1

冷凍保藏

冷凍保藏為保藏微生物菌種最簡單而有效方法。經(jīng)過冷凍，使微生物代謝活動停頓。普通而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了取得滿意冷凍結果，通常應在培養(yǎng)物中加入一定冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應認真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏缺點之一是培養(yǎng)物運輸較困難。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第174頁冷凍保藏種類

一、普通冷凍保藏技術(-20℃)二、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)三、液氮冷凍保藏技術

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第175頁普通冷凍保藏技術(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保留。用此方法能夠維持若干微生物活力1—2年。抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第176頁應注意是經(jīng)過一次解凍菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。這一方法雖簡便易行，但不宜多數(shù)微生物長久保藏?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第177頁二、超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)要求長久保藏微生物菌種，普通都要求在-60℃以下進行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種普通方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期微生物細胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲細胞；

3．加入等體積20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第178頁假如待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱冷凍速度普通控制在1-2℃／min。若干細菌和真菌菌種可經(jīng)過此保藏方法保藏5年而活力不受影響?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第179頁三、液氮冷凍保藏技術

(一)冷凍保護劑

在液氮冷凍保藏中，最常見冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度普通為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第180頁(二)液氮冷凍保藏微生物菌種步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，

抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第181頁(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，假如菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將全部封好安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細胞和懸浮培養(yǎng)基之間到達平衡?？股禺a(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第182頁2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機冷凍室中；(3)以1-2℃/min致冷速度降溫，直到溫度到達相對溫度之上幾度細胞凍結點(通常為-30℃)；(4)補加一定量液氮至系統(tǒng)中，使細胞在凍結點時盡可能快地發(fā)生相變；抗生素產(chǎn)生菌的菌種篩選及優(yōu)化第183頁(5)細胞凍結后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達-50℃；(6)將安瓿快速移入液氮罐中于氣相(-96℃)或液相(-156