電鏡技術(shù)及超薄切片技術(shù)(研究生)

電鏡技術(shù)方周溪目前一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點目前二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

電鏡室現(xiàn)有設(shè)備1、H-7500型透射電鏡，購于2004年，最大點分辨率為0.24nm,有效放大倍數(shù)達(dá)60萬倍。2、S-3000N型掃描電鏡，購于2004年，有效放大倍數(shù)達(dá)30萬倍。3、輔助設(shè)備：Tome-PowerXL超薄切片機(jī)，零界點干燥儀，離子濺射儀等。

目前三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1924年，法國Broglie提出了“電磁波與光一樣，具有波動性“的假說，并計算出電磁波長為0.005nm.1926年，德國科學(xué)家Busch發(fā)現(xiàn)了帶電粒子在電場或磁場中偏轉(zhuǎn)聚焦的現(xiàn)象。1928—1931年間，德國的Ruska成功研制了世界上第一臺真正的電子顯微鏡，放大倍數(shù)為1200倍。20世紀(jì)50年代初到60年代末期，電鏡分辨本領(lǐng)得到大幅度提高，達(dá)到1nm左右，到80年代的點分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高壓透射電鏡（1000KV)的點分辨率可高達(dá)0.001nm。目前四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

電鏡基本類型一、透射式電子顯微鏡二、掃描式電子顯微鏡三、根據(jù)電子槍發(fā)射方式不同，可分為熱陰極電子槍和場發(fā)射電子槍。四、其他

（冷凍或低溫電子顯微鏡、高壓或超高壓電子顯微鏡、分析電鏡、掃描隧道顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、掃描光子顯微鏡、原子力顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡等約幾十種不同類型電鏡）目前五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點舉例說明：清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院院長施一公帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊在《科學(xué)》在線發(fā)表了兩篇研究長文，揭示了剪接體結(jié)構(gòu)及其工作機(jī)理。舉例來說，一個蘋果，它本身是三維的，我們拿二維照相機(jī)多方位、多角度地拍很多張照片，就能重構(gòu)出蘋果的三維模型。（三位重構(gòu)技術(shù)）其實冷凍電鏡就相當(dāng)于一個照相機(jī)，當(dāng)選好的冷凍樣品被送到冷凍電鏡時，會生成很多圖像，這些圖像組合起來便可以構(gòu)建一個三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)收集到大量剪接體的圖像后，就可以重構(gòu)一個剪接體的三維結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在科學(xué)研究中，科研儀器扮演者越來越重要的角色，這些儀器依托于科學(xué)家研發(fā)的技術(shù)，是科學(xué)家眼睛、手和腦的延伸。由于生理結(jié)構(gòu)，人類的一些功能會有局限性，實驗必須借助儀器來完成。目前六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點主要內(nèi)容1、電鏡的基本原理和結(jié)構(gòu)簡介(了解）2、電鏡的樣品制備（透射電鏡和掃描電鏡）（重點在于取材方面）3、電鏡的應(yīng)用簡介（熟悉）目前七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡在工作原理上的比較：

光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進(jìn)行折射，將一物點發(fā)出不同角度的光線最終會聚成一個像點。

電子顯微鏡是利用電場或磁場（電磁透鏡）折射高速電子束流，達(dá)到成像目的。

目前八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點光源聚光鏡樣品物鏡投影鏡最終象透射電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡目前九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

透射電子顯微鏡的原理和結(jié)構(gòu)

光的衍射現(xiàn)象：

由于光具有波動性，當(dāng)光線通過小孔或小孔光源經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成象會產(chǎn)生衍射。其圖案是:中央部分一個亮斑，在其周圍有明暗交替的圓環(huán)。2D目前十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點顯微鏡的分辨本領(lǐng)顯微鏡分辯本領(lǐng)是由其產(chǎn)生的衍射圖中央亮斑半徑D（分辨能力）大小來決定的即

D=

當(dāng)光的波長為λ=500nm=0.5μm

介質(zhì)折射率（油）=1.5

物體與物鏡所形成夾角的半數(shù)α<90o

央亮斑的半徑D=200nm

=0.2μm

目前十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1、人眼在明視距離250mm處能分辨0.2mm的兩點。

油鏡最小能分辨0.2μm的兩點。

則油鏡理論最大放大能力為：

0.2mm/0.2μm=1000（倍）2、假如一臺電鏡的點分辨率為0.1nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.1nm=2x1063、H-7500型透射電鏡的點分辨率為0.24nm,則其理論放大倍數(shù)為：0.2mm/0.24nm=0.83x106。而其有效放大倍數(shù)為0.6x106目前十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

光線通過二個比較靠近的小孔時，這二個小孔的衍射圖會重疊在一起。當(dāng)一個衍射圖的中央亮斑正好落在另一個衍射圖的第一暗環(huán)中心時，這二個點剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準(zhǔn)則。瑞利準(zhǔn)則：目前十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點什么是電磁透鏡？由于軸對稱彎曲磁場對電子束有聚焦作用，因而可以得到電子光學(xué)像。我們稱這種具有軸對稱彎曲磁場裝置構(gòu)成的電子透鏡為電磁透鏡（electronmagneticlenses）。由于電磁透鏡磁場非均勻分布，物、像點在磁場之外，電子在磁場中既受到軸向分量的作用，又受到徑向分量的作用，使平行于軸進(jìn)入磁場的電子束可獲得聚焦。目前十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電磁波長的計算

根據(jù)公式λ=(nm)

如V=50000v

則λ=0.005nm=0.000005μm

代入公式D=則D=0.000002μm目前十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡的像差和畸變

①球差：電子束光源通過透鏡受到偏轉(zhuǎn)，通過樣品，從物平面向下發(fā)射，形成物點孔徑角。從物點發(fā)出的射線，到達(dá)下一級透鏡又被聚集。如果透鏡有缺陷或孔徑角太大，則靠近光軸的射線和遠(yuǎn)離光軸的射線，受到電磁場的作用就會不同，這些射線在光軸上會聚的位置不同，結(jié)果遠(yuǎn)離光軸的射線就會在像面上形成一個最小模糊圈。此時可有圖象中央凸起感。這是目前影響電鏡分辨率的一個主要因素。目前十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點②像散：由于透鏡的磁場強(qiáng)度在縱向或橫向上不同，以致縱向與橫向上的射線聚焦于光軸的位置也有上有下，兩者共同形成一個最小模糊像。③色差：由于電磁波長隨加速電壓而變化，當(dāng)加速電壓不穩(wěn)定時，電子束波長就可變異，因而發(fā)生類似的像差。目前十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

④畸變：由于離軸較遠(yuǎn)處的徑向磁場的作用力強(qiáng)，使放大倍數(shù)隨物點離軸的距離而變化，進(jìn)而使圖象發(fā)生改變而產(chǎn)生的。畸變常見的有枕形畸變、桶形畸變和S形畸變等，如圖所示：目前十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點反差人的眼睛在區(qū)分物體時，主要根據(jù)物體不同部位或物體之間的光強(qiáng)度與波長的差別，這些差別構(gòu)成了物體的反襯度，又稱為“反差”。電鏡與光鏡一樣也存在反差現(xiàn)象。由于電鏡標(biāo)本上的不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，疏密度不同，它們散射電子的能力也各不相同，散射電子能力強(qiáng)的地方，顯現(xiàn)為暗像；相反，散射能力弱的地方，顯現(xiàn)為亮像。因此，在熒光屏上所看到的是由暗像與亮像組成的具有一定反差的熒光圖像。目前十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1、照明系統(tǒng)：

電子槍：可分為熱陰極和場發(fā)射兩種。前者主要有鎢絲(W)和六硼化鑭(LaB6)；后者又分熱場發(fā)射和冷場發(fā)射，一般采用的是單晶鎢，但現(xiàn)在有采用六硼化鑭(LaB6)的趨勢。聚光鏡2）樣品室3）成象系統(tǒng)：物鏡中間鏡投影鏡4）觀察記錄系統(tǒng)：觀察室照相機(jī)CCD數(shù)字成像系統(tǒng)

5）輔助系統(tǒng)目前二十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點透射與掃描電鏡原理圖解目前二十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點掃描電子顯微鏡工作原理及結(jié)構(gòu)通過極細(xì)的電子束掃描射擊標(biāo)本表面而激發(fā)出二次電子或產(chǎn)生反射電子，并通過一定途徑被接收到陰極射線管而成像。掃描電鏡由兩個主要部分組成：探查系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)目前二十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點一、探查系統(tǒng)：由電子槍、電磁透鏡組成。

二、顯示系統(tǒng)：電子檢測器，閃爍器，光電倍增器以及顯示屏組成。

目前二十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點目前二十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

電子束的穿透能力一般較弱，大多數(shù)標(biāo)本無法直接在電鏡下觀察，必須把樣品切成厚度為10—1000nm的薄片。我們把切片厚度小于100nm的薄片稱為超薄切片，是電鏡觀察生物樣品常用方法之一，常用厚度為50-100nm。(1)

超薄切片技術(shù)二、透射電子顯微鏡樣品制備目前二十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點透射電鏡樣品制備(包埋塊制作）操作流程：

取材——漂洗（生理鹽水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小時以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定(1%鋨酸1小時左右）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——塊染（1%醋酸鈾2小時）——梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘，100%2次，各10分鐘）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37oC烘箱2小時；丙酮：包埋液=1：4，37oC烘箱過夜；純包埋液45oC烘箱2小時）——包埋聚合（45oC烘箱3小時，65oC烘箱48小時）目前二十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點透射電鏡樣品制作示意圖目前二十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

取材要點及注意事項

快：取材時間在1—2分鐘以內(nèi)完成；

小：體積大小在1立方毫米左右或橫切面為1平方毫米的長條形；

冷：固定液溫度在4攝氏度左右。

準(zhǔn)：取材部位要準(zhǔn)確，盡量取材于所要觀察的部位。目前二十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點取材方法介紹：

1、器官組織取材法：主要針對活體器官組織的取材如腎、肝、肺等活檢組織2、游離細(xì)胞收集法：主要針對培養(yǎng)細(xì)胞及游離細(xì)胞如血細(xì)胞、脫落細(xì)胞等。常用方法有血漿或血清預(yù)包埋法。目前二十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點標(biāo)本取材方向及大小示意圖目前三十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點雙刀切割法目前三十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點常見臟器的取材簡介目前三十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點１、灌注固定

2、注射固定3、浸泡固定

4、位置選擇：要觀察生精細(xì)胞或支持細(xì)胞，取材于睪丸的睪丸網(wǎng)部位，大鼠與小鼠的睪丸網(wǎng)比較表淺，就在白膜下附近。如果要觀察成熟精子，最好取材于附睪的尾部，此處精子已基本成熟，而且精子密度最高。睪丸組織取材方法目前三十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點肝組織取材法1、灌注固定法2、浸泡固定法動物經(jīng)麻醉后打開腹腔，暴露出肝臟，選取一片肝小葉（如左小葉），先用細(xì)線扎緊小葉間連接部位防止出血，接著用手術(shù)剪剪下這片小葉組織放在滴有固定液的蠟板上進(jìn)行修塊，切成1立方毫米大小即可。目前三十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1、腦組織灌注固定（4%多聚甲醛溶液）２、取材位置選擇：如研究腦神經(jīng)軸索、髓鞘以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，建議取材于腦組織白質(zhì)部分，此處有髓神經(jīng)纖維相對較多，膠質(zhì)細(xì)胞比較豐富；如要研究神經(jīng)元以及血腦屏障結(jié)構(gòu)，建議取材于腦皮質(zhì)的灰質(zhì)部分。３、定向包埋，以神經(jīng)元長軸方向（大約為腦組織的矢狀面）作為切面方向，這樣可以很好地觀察神經(jīng)元細(xì)胞核、軸突以及樹突結(jié)構(gòu)的變化，突觸以及毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)也比較容易見到。

目前三十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點１、灌注固定2、浸泡固定：

載玻片擠壓法：將組織放在載玻片上，并將固定液滴在其上，用另外一片載玻片輕輕壓在上面并輕輕擠壓。

3、位置選擇：如果以研究支氣管粘膜或研究肺動脈為主的（這里指肺內(nèi)的支氣管），盡量取材于靠近肺門部位。如果主要研究肺泡上皮細(xì)胞、終末細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管以及肺泡隔的結(jié)構(gòu)等，建議取材于肺葉靠近胸膜一側(cè)或者肺尖部。肺組織取材法目前三十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點１、灌注固定或浸泡固定（主要是腎穿刺活檢）２、位置選擇：根據(jù)需要切取皮質(zhì)或髓質(zhì)進(jìn)行觀察。動物腎組織取材要注意的是，一要取材位置選擇在腎的上極，二要準(zhǔn)確判定皮質(zhì)與髓質(zhì)的位置，如果是皮質(zhì)部位，只要將包膜分離后，將腎最外層組織取下來即可，這里一般都會有腎小球存在。一般要求切長條形。腎組織取材法目前三十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

胃腸道取材法

剖開胃腸道腔，暴露出粘膜面，用PBS或生理鹽水浸洗內(nèi)腔，盡量清洗干凈，但注意保護(hù)好粘膜面以免損傷，然后剪一段組織進(jìn)行修塊。具體做法如下：沿著胃腸道縱軸和橫軸各切幾條長約2毫米，寬約1毫米的長條形組織，盡量包括粘膜全層結(jié)構(gòu)，以直接浸泡固定方法為宜，注意保護(hù)粘膜層細(xì)胞免受人為損傷。各實驗組選取部位盡量在相同部位，以利實驗比較。目前三十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點骨組織取材方法取小塊骨片（1～2mm大小），先用2.5%戊二醛固定2小時，磷酸緩沖液漂洗2次，再將骨片浸入脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理，視脫鈣效果而定脫鈣時間，如用EDTA脫鈣液，大約3天時間，主要視組織塊是否變得柔軟，通常用細(xì)針刺脫鈣骨片是否容易刺穿來判斷脫鈣效果。軟骨組織一般直接固定，不需要脫鈣處理。目前三十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點皮膚組織取材方法皮膚組織一般觀察表皮細(xì)胞及部分固有層結(jié)構(gòu)，取材以長條形為主，長約1.5mm,橫徑在0.5mm-1.0mm,包括表皮全層細(xì)胞及部分固有層（依據(jù)上文定向取材圖示處理），表皮是復(fù)層鱗狀上皮層，無血管分布。真皮部分位于表皮深面，主要由膠原纖維和彈性纖維交織構(gòu)成，并含有從表皮陷入的毛發(fā)和腺體，以及從深層來的血管、淋巴管、神經(jīng)及其末梢，一般不需要定向取材，但要注意位置的準(zhǔn)確。目前四十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點外周神經(jīng)纖維的取材方法脊椎動物的外周神經(jīng)系統(tǒng)包括由腦發(fā)出的腦神經(jīng)和由脊髓按節(jié)段性排列發(fā)出的脊神經(jīng)。按所聯(lián)系的器官不同，可分為軀體和內(nèi)臟兩大類，每一類又可按照傳導(dǎo)興奮的方向不同而分為傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)兩類。取神經(jīng)纖維時，應(yīng)先分離掉包裹神經(jīng)的神經(jīng)外衣，再分離出所要研究的神經(jīng)。如果神經(jīng)纖維直徑在1mm以內(nèi)，可直接切成1.5mm長條形即可，如果直徑較大，則一分為二，同樣切成長條形。需要注意的是，在包埋的時候必須定向包埋，縱橫方向都要包埋。目前四十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點肌肉的取材方法每塊肌肉都是具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的器官，有豐富的血管、淋巴管分布，在軀體神經(jīng)支配下收縮或舒張，進(jìn)行隨意運動。肌肉具有一定的彈性，當(dāng)外界刺激較激烈的情況下，肌肉往往出現(xiàn)痙攣現(xiàn)象，因此，切取肌肉組織后應(yīng)先浸泡在生理鹽水或磷酸緩沖液中，等肌肉恢復(fù)自然常態(tài)后再取材，縱橫方向都要取，以長條形為主，大小約1*1*1立方毫米，然后浸入固定液內(nèi)進(jìn)行固定，需要注意的是，在取心肌的時候應(yīng)取在心尖部位，在包埋的時候必須定向包埋。目前四十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點胰腺的取材方法胰腺可分為胰頭、胰體和胰尾三部分。胰腺一般觀察胰島細(xì)胞、腺泡細(xì)胞以及導(dǎo)管細(xì)胞，胰島主要分布在胰尾部位，胰體部位較少，腺泡及導(dǎo)管基本存在于胰體內(nèi)，容易觀察。組織可以直接浸入固定液內(nèi)固定。值得注意的是，由于胰腺腺泡內(nèi)酶原顆粒較豐富，容易引起細(xì)胞自溶，取材時要盡量快速取材以免細(xì)胞自溶影響結(jié)果。目前四十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點腫瘤組織取材方法腫瘤的生長位置幾乎遍布全身，腫瘤組織主要觀察腫瘤細(xì)胞的組織來源、細(xì)胞類型、分化程度以及與周圍組織的關(guān)系等內(nèi)容。電鏡標(biāo)本的取材應(yīng)多位置取材，包括腫瘤的實體內(nèi)部、生長發(fā)生部位、與周圍正常組織的交界部位以及癌旁組織。各部位均要取若干個組織塊進(jìn)行固定，這樣才能觀察的比較全面，尤其懷疑是惡性腫瘤的組織。大小約1mm*1mm*1mm,不能過大。目前四十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點游離細(xì)胞取材法血漿凝集法：將抗凝全血離心分層（2000轉(zhuǎn)/每分鐘，10—20分鐘），用毛細(xì)吸管沿著管壁輕輕的將上清夜吸?。ú灰茐陌准?xì)胞層），接著用吸管吸取固定液，并沿著管壁將2.5%戊二醛固定液慢慢地加入進(jìn)行固定，然后把它放在4℃冰箱內(nèi)保存。血漿（血清）混合法：如為細(xì)菌、病毒、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞則先將它們制成懸液放置于離心管內(nèi)（最好是玻璃的），離心成團(tuán)（1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分鐘左右，離心，再棄去多余的固定液，然后和少量抗凝血漿或血清混合均勻，離心成團(tuán)，去上清液（留少許），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入，盡量避免團(tuán)塊分散，靜置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。目前四十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點雙重固定法：

1、固定目的是盡量保持細(xì)胞生活時的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及減少細(xì)胞的死后變化。

2、前固定一般采用2.5%戊二醛溶液固定，后固定采用1%鋨酸溶液固定

3、常用固定劑：2.5%戊二醛、1%鋨酸、

4%多聚甲醛溶液、福爾馬林、高錳酸鉀等，有時還用戊二醛-多聚甲醛混合固定液固定。目前四十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點固定不良，染色淡，結(jié)構(gòu)不清晰固定較好，染色較深目前四十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1．組織塊固定：切割小塊浸入固定液中的方式。2．游離細(xì)胞的固定：有離心法和懸浮制備法。3.原位固定法：結(jié)扎相應(yīng)血管，在臟器表面切割“井”字型，然后直接在該表面上滴加固定液進(jìn)行固定。4.灌注固定法：目前比較廣泛采用，效果較好。幾種化學(xué)固定方式：目前四十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

漂洗

目的是徹底洗凈戊二醛固定液的殘余，防止其與鋨酸起化學(xué)反應(yīng)而降低固定效果。常用漂洗液為0.1M的磷酸緩沖液（PBS）和二甲砷酸鈉緩沖液（注意有毒性）。目前四十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

塊染

就是對組織塊進(jìn)行1%醋酸雙氧鈾整塊染色。時間為1—2小時。

脫水（酒精或丙酮）梯度脫水：70%丙酮15分鐘，80%丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮１0分鐘(二次)。

關(guān)鍵在于純丙酮脫水！目前五十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

浸泡與包埋浸泡：使某種適宜的液體介質(zhì)（包埋劑）滲入組織塊取代脫水劑。包埋：使浸入的介質(zhì)（環(huán)氧樹脂包埋劑）經(jīng)高溫處理后聚合為固體，將組織塊包埋其中，利于超薄切片。

常用包埋劑：Epon-812環(huán)氧樹脂、DDSA、MNA以及加速劑DMP-30等。特別注意：操作過程中要嚴(yán)防包埋劑吸潮!

目前五十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點包埋劑的理想性質(zhì)理想的包埋劑應(yīng)具有以下性質(zhì)：(1)．粘度低，容易滲入組織；(2)．聚合均勻而充分，聚合前后體積變化??；(3)．有良好的切割性能；(4)．能耐受電子束轟擊，高溫下不變形；(5)．對細(xì)胞成分抽提少，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好；(6)．在電鏡的高倍放大下，本身不顯示任何結(jié)構(gòu)；(7)．材料來源豐富、易得，價格低廉，對人體無害。目前五十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點超微病理標(biāo)本微波快速制備流程：（了解）取材（按常規(guī)要求方法）——3%戊二醛固定后經(jīng)微波高火照射20秒,室溫繼續(xù)固定20分鐘——1%磷酸緩沖液漂洗4次，每次5分鐘，微波中火照射20秒——1%鋨酸微波中火照射10秒，室溫繼續(xù)固定20分鐘——丙酮50%、70%、80%、90%脫水，微波中火照射20秒，室溫繼續(xù)脫水2分鐘。100%丙酮脫水3次，每次微波中火照射20秒，室溫3分鐘——丙酮：包埋劑=1：1浸透，微波中火照射20秒，室溫繼續(xù)浸透5分鐘——丙酮：包埋劑=1：3浸透，微波中火照射20秒，室溫繼續(xù)浸透5分鐘，2次——純包埋劑微波中火照射20秒，室溫10分鐘——常規(guī)包埋——聚合：70℃20分鐘，95℃30分鐘，110℃60分鐘——半薄切片光鏡定位——超薄切片——醋酸鈾微波中火照射染色30秒，雙蒸餾水漂洗——枸櫞酸鉛微波中火照射染色20秒，雙蒸餾水漂洗——45℃烘箱干燥——電鏡觀察。注意：高火：600——800W；中火：約400W。目前五十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點超薄切片流程

1、切片前的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)清洗（用丙酮和乙醇浸洗）

2、支持膜制備：常用Formvar膜（聚乙烯醇縮甲醛）由氯仿配置，濃度為0.5%。

3、玻璃刀制備：專用制刀機(jī)制作。

4、半薄切片光鏡定位（需要了解組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)）。5、超薄切片：專用超薄切片機(jī)切片，需要培訓(xùn)。厚度在50—100nm之間較為合適。6、染色：檸檬酸鉛-醋酸鈾雙重染色法。如果前面已經(jīng)進(jìn)行塊染的，只要鉛染即可。目前五十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡觀察、拍片、記錄等

首先，觀察人員要熟悉電鏡的基本操作程序以及所要觀察材料的相關(guān)知識。熟悉CCD數(shù)字成像系統(tǒng)的基本操作程序。其次，做好觀察記錄，選好范圍拍片，準(zhǔn)確記錄底片號碼及相應(yīng)內(nèi)容。。最后，做好各種資料的整理、備案工作。目前五十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

取材（做好樣品觀察面的標(biāo)志）——漂洗（生理鹽水或緩沖液）——固定（2.5%戊二醛2小時以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定（1%鋨酸，2小時）——脫水（50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘，換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘）——干燥（零界點干燥或冷凍干燥）——鍍膜（真空鍍膜儀或離子濺射儀）掃描電鏡樣品制備流程目前五十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點

負(fù)染技術(shù)

觀察顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。用重金屬鹽沉積到樣品四周，樣品四周散射電子的能力就較強(qiáng)，因而表現(xiàn)為暗區(qū)；樣品本身散射電子的能力較弱，則表現(xiàn)為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。常用磷鎢酸鹽或醋酸鈾溶液。目前五十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在光鏡細(xì)胞化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的一門技術(shù)。酶存在的特定位置稱為酶的定位。主要通過酶的活性作用結(jié)果間接地證明酶的存在。目前能在電鏡下定位的酶有三大類即水解酶、氧化酶和轉(zhuǎn)移酶，有100多種。注意：在整個處理過程中必須保存酶的活性不受破壞。目前五十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點以下以氧化還原酶（可分為氧化酶和脫氫酶兩種）為例進(jìn)行說明。

在氧化酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)中含有兩個既分開又緊密聯(lián)系的底物，一個是生理底物如氧或過氧化氫；另一個是捕捉底物，通常是四鹽酸3，3‘二氨基聯(lián)苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，經(jīng)過一系列化學(xué)變化生成強(qiáng)嗜鋨性的聚合物，再經(jīng)鋨酸固定就形成鋨黑。

目前五十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點脫氫酶常用的捕捉劑為鐵氰化物，它在酶的作用下被還原為亞鐵氰化物，在銅離子的存在下進(jìn)一步形成高度不溶性的亞鐵氰化銅沉淀。目前六十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點酶細(xì)胞化學(xué)的常規(guī)操作流程1、固定：常規(guī)固定液選取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作為固定液，常用的緩沖液有二甲砷酸鈉緩沖液及Tris緩沖液等。2、切片：一般采用組織切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度在40～60μm，也可以用冰凍切片機(jī)切片。3、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進(jìn)行漂洗3次，每次10分鐘。4、孵育：孵育時必須在使用前配置新鮮孵育液。將切片放入孵育液內(nèi)，在震蕩式恒溫水浴箱中孵育，孵育溫度一般為37℃。5、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進(jìn)行漂洗3次，每次10分鐘，然后用

0.1M二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3次，每次10分鐘，所用緩沖液要保持在4℃左右。6、后固定：用0.1M二甲砷酸鈉緩沖液配置的1%鋨酸固定1小時。脫水、浸透、包埋、切片同常規(guī)超薄切片制作。7、電鏡觀察：超薄切片經(jīng)烘干后直接進(jìn)行電鏡觀察。如果反差不好，可以進(jìn)行鉛—鈾雙重染色，但必須有不染色的切片對照。目前六十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點免疫電鏡膠體金標(biāo)記技術(shù)

免疫電鏡膠體金標(biāo)記技術(shù)也稱金標(biāo)法（或免疫金染色）。金標(biāo)法是利用膠體金（Colloidalgold）在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相吸引，從而將抗體標(biāo)記。電鏡下金顆粒密度很高，清晰可辨。膠體金是金的水溶膠，主要用還原法制備。較多用的還原劑有枸櫞酸鈉、白磷、鞣酸、乙醇、抗壞血酸、過氧化氫等。目前六十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點枸櫞酸三鈉還原法

1）取0.01%氯化金（HAuCl4或AuCl3HCl溶液）100ml，放入潔凈錐形瓶內(nèi)煮沸。2）取1%枸櫞酸三鈉水溶液4ml，加入煮沸的氯化金中。3）混合、攪拌、煮沸，約5分鐘，溶液顏色由藍(lán)→紫→橙紅，冷卻后即可。此時膠體金顆粒直徑約為15nm。如將枸櫞酸三鈉的量分別減少至1.5ml、1.0ml、0.75ml,則膠體金顆粒直徑將分別增至30、50或60nm.目前六十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點膠體金標(biāo)記物（金探針）的制備

1、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)及其純化

1）取100ml膠體金PH為7.2。

2）稱取相應(yīng)最適量蛋白質(zhì)，于去離子水中溶解（100ul）。

3）在磁力攪拌器中將上述兩液混合、靜置。

4）10分鐘后再加入膠體金穩(wěn)定劑，如3%聚乙二醇（PEG）或5%

小牛血清白蛋白（BSA）。

5）用超速離心法去除未標(biāo)記蛋白質(zhì)。離心速度和時間取決于金顆粒大小及蛋白質(zhì)的種類。膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG，以牛血清白蛋白穩(wěn)定者，先用低速離心20分鐘（金顆粒20nm者用250轉(zhuǎn)/分，5nm者用4000轉(zhuǎn)/分，視金顆粒實際大小情況而定離心速度）。留取上清液，再以高速離心，4℃下離心1小時（金顆粒20nm者用14000轉(zhuǎn)/分，5nm者用60000轉(zhuǎn)/分，視金顆粒實際大小情況而定離心速度）。棄上清液，留取沉淀物備用。

6）將沉淀物用0.02MPBS(pH8.2,內(nèi)含1%BSA或PEG)懸浮、清凈，高速離心，重復(fù)三次，最后將膠體金標(biāo)記物溶于原液體積1/10的TBS中，即可應(yīng)用。目前六十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點免疫金染色法，可分為

包埋前染色和包埋后染色。

包埋前染色對細(xì)胞膜的穿透性差，

一般只用于細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記。

因此，現(xiàn)今普遍采用包埋后染色。目前六十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡包埋后膠體金染色法

1）超薄切片80nm左右置于無支持膜的鎳網(wǎng)上。2）至1～10%H2O2液中處理10分鐘～1小時不等，越硬需要H2O2濃度越高越利于抗體進(jìn)入。3）雙蒸餾水洗3次，每次5～10分鐘。4）浮于正常羊血清（1：50～1：100）液滴上，室溫30～60分鐘，或1：5，5分鐘。5）PBS漂洗3分鐘，PBS（內(nèi)含1%牛血清白蛋白）PH8.2中，5分鐘。6）加適量稀釋的膠體金標(biāo)記抗體液（1：30～1：100），淡紅色為適宜稀釋液，4℃20小時或室溫10分鐘～2小時。7）雙蒸餾水洗3次，每次3分鐘。8）如做雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復(fù)2～7步驟。9）5%醋酸鈾染色，5分鐘，雙蒸餾水洗滌，3次。10）枸櫞酸鉛染色，5分鐘，雙蒸餾水充分洗滌。11）干燥后電鏡觀察。結(jié)果：陽性抗原部位聚集金顆粒。目前六十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點標(biāo)本回顧性研究——

石蠟塊做超薄切片技術(shù)1、定位取材：根據(jù)光鏡顯示，切取需要的部位，大小約1mm3

的若干小塊。2、溶蠟：先在37℃烘箱內(nèi)熔蠟4小時，再二甲苯37℃烘箱內(nèi)

浸泡8—12h，期間要震蕩搖換一次。3、水化：用100%（1小時）、90%、80%、70%丙酮進(jìn)行水化（各15分鐘），直到完全水化。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液或二甲砷酸鈉緩沖液)兩次，各15分鐘。5、固定：用2.5%戊二醛固定2小時以上，其余步驟同常規(guī)電鏡樣品制作處理。目前六十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點1、生命科學(xué)上的應(yīng)用：幾乎包括所有的學(xué)科研究領(lǐng)域都已經(jīng)用到或即將用到電鏡技術(shù)。比如動物或植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及其細(xì)胞器等內(nèi)容物、細(xì)胞間的連接等）的形態(tài)觀察，通過對比觀察，對動植物形態(tài)在超微結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行分類、分型，以探討遺傳、變異及病理病因的機(jī)理或機(jī)制，為生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究所不可或缺的研究手段。利用常規(guī)電鏡技術(shù)和特殊電鏡技術(shù)如免疫電鏡技術(shù)、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡原位雜交技術(shù)等可以進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及超微病理分析，以及細(xì)胞內(nèi)抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。電鏡應(yīng)用簡介目前六十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點2、在臨床診斷中的應(yīng)用：主要應(yīng)用于臨床活檢組織的超薄切片觀察分析。通過活檢組織的細(xì)胞形態(tài)變化及其相互間的關(guān)系，根據(jù)其形態(tài)變化規(guī)律和特點進(jìn)行分析診斷，為臨床病理診斷或輔助診斷提供較可靠的形態(tài)依據(jù)。在鑒別腫瘤組織來源、分化程度、浸潤情況等，以及疾病的病理分型或分期和疾病的早期病理改變等方面，電鏡比光鏡具有一定的優(yōu)勢。病原微生物（如細(xì)菌、病毒、支原體、囊蟲等）的形態(tài)觀察或鑒別也是電鏡觀察的強(qiáng)項。目前六十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點3、材料上的應(yīng)用：包括材料的內(nèi)、外部結(jié)構(gòu)或形貌觀察，顆粒形態(tài)、大小測量、排列分布等情況。如果應(yīng)用能譜分析儀器，就可以檢測材料的元素組成、含量、分布等情況。4、其他領(lǐng)域上的研究：如礦物質(zhì)、考古等。目前七十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點如何拍攝電鏡照片電鏡拍攝既是一門技術(shù)，又是一門藝術(shù)。先低倍，后高倍；先大體，后局部；先對照，后模型，再療效。目前七十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點目前七十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡應(yīng)用及超微結(jié)構(gòu)目前七十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點支原體絨毛內(nèi)支原體細(xì)菌卡氏肺囊蟲隱球菌－可見莢膜肺內(nèi)大腸桿菌感染目前七十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點艾滋病病毒艾滋病病毒ＳＡＲＳ病毒乙型肝炎病毒目前七十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點核仁細(xì)胞核質(zhì)膜內(nèi)褶線粒體溶酶體目前七十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點卵細(xì)胞示意圖透明帶卵黃顆粒人類卵細(xì)胞局部結(jié)構(gòu)精子鞭毛橫斷面９＋２系統(tǒng)小鼠精子結(jié)構(gòu)線粒體鞘石璜精子結(jié)構(gòu)泥螺精子細(xì)胞尾部結(jié)構(gòu)細(xì)胞核目前七十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點核固縮突觸結(jié)構(gòu)中心體神經(jīng)元細(xì)胞心肌細(xì)胞線粒體固縮胃腺癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移肌絲溶解現(xiàn)象RER版層狀排列目前七十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十點骨骼肌糖原沉積Cap血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)彈力板脫髓鞘現(xiàn)象細(xì)胞質(zhì)溶解弓形蟲感染細(xì)胞肝細(xì)胞淋巴細(xì)胞隱窩細(xì)胞目前七十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十點病毒顆粒ＲＥＲ電子致密物細(xì)胞水腫細(xì)菌菌毛細(xì)胞壁肝細(xì)胞糖原沉積粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)目前八十頁\總數(shù)九十一頁\編于十點白血病淋巴細(xì)胞膠體金顆粒巨噬細(xì)胞吞食現(xiàn)象納米碳管目前八十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十點足細(xì)胞及足突結(jié)構(gòu)近曲小管上皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)－縱切近曲小管上皮細(xì)胞微絨毛足細(xì)胞足突溶酶體線粒體微絨毛（刷狀緣）目前八十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十點果蠅果蠅復(fù)眼米象目前八十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十點金屬出芽觸角頭發(fā)晶體粘膜表面化纖目前八十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十點細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)菌腫瘤細(xì)胞目前八十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十點人造纖維人造血管微球目前八十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十點電鏡技術(shù)練習(xí)題1、透射電鏡標(biāo)本取材的基本要求并簡要說明。2、什么是瑞利準(zhǔn)則？電鏡與光鏡在原理上有何相似和不同之處？3、簡述透射電鏡及掃描電鏡樣品制作流程4、常用的化學(xué)固定方法有哪些？5、普通透射電鏡包括那些結(jié)構(gòu)？請簡要敘述。6、簡述電鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用7、簡述電鏡的球差和畸變及其形成原因。8、簡述電磁透鏡及其聚焦原理9、什么是反差？簡述電鏡熒光圖像反差形成的原因。10、游離細(xì)胞取材方法有哪些?并簡述其處理方法。11、簡述超薄切片流程并簡要說明。12、簡述石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程13、簡述負(fù)染技術(shù)及其應(yīng)用。目前八十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十點選擇題人眼的平均分辨率為（

）A0.4mmB0.2mmC0.3mmDO.2μmE0.4μm電子槍產(chǎn)生的電子是（

）A入射電子B透射電子C彈性散射電子D二次電子E俄歇電子用來顯示組織和細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)像的電子為（

）A入射電子B透射電子C彈性散射電子D二次電子E反射電子下面哪項不屬于透射電鏡樣品制備技術(shù)（

）A鍍膜B負(fù)染技術(shù)C電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)D超薄切片技術(shù)