蛋白質(zhì)研究方法演示文稿

優(yōu)選蛋白質(zhì)研究方法演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1蛋白質(zhì)提取分離要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，通常需要從某一復(fù)雜的體系中分離純化目的蛋白。蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上差異很大，即使是同類蛋白質(zhì)，因選材不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。目前二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)分離純化流程目前三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)但一般分離中的關(guān)鍵部分的基本手段是相同的，大部分蛋白質(zhì)可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)（酶）。目前四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)實(shí)驗(yàn)前應(yīng)查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，了解欲分離提純物質(zhì)的理化及生物學(xué)性質(zhì)。對(duì)于未知結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的試樣進(jìn)行創(chuàng)造性的分離提純時(shí)，需要經(jīng)過(guò)各種方法比較和摸索，才能找到規(guī)律和獲得預(yù)期結(jié)果。目前五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)在分離提純工作前，須建立相應(yīng)的分析鑒定方法，以正確指導(dǎo)整個(gè)分離純化工作的順利進(jìn)行。高度提純某一生物大分子，一般要經(jīng)過(guò)多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達(dá)到目的。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)劣，選擇條件效果的好壞，需要通過(guò)分析鑒定來(lái)判斷。目前六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。因此，分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白溶解差異的原因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用。目前七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)：白蛋白和球蛋白：溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿，可被50%飽和度硫酸銨析出。真球蛋白：一般在pI時(shí)不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白：溶于水，可為50%飽和度硫酸銨析出。目前八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)醇溶蛋白：溶于70～80%乙醇中，不溶于水及無(wú)水乙醇?xì)さ鞍祝涸趐I不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質(zhì)：不溶于水、鹽、稀酸及稀堿目前九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)綴合蛋白：包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等。此類蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)結(jié)合部分的不同而異，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂肪部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢(shì)。目前十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的制備主要原理：①利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配于可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等；②將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。目前十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)由于蛋白質(zhì)不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固相和液相，并在這兩相間互相交替進(jìn)行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質(zhì)及溶解度等主要因素進(jìn)行分類。目前十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)按分子大小和形態(tài)分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結(jié)晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。目前十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)常與其他物質(zhì)以結(jié)合形式存在。如極微量的金屬和糖對(duì)巨大蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起決定作用，若被除去則不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)晶化的難度也隨之增加。目前十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力等維持，構(gòu)象很不穩(wěn)定。為得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，盡量采用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，并還要注意防腐。一些共存成分的影響。如蝮蛇粗毒的蛋白質(zhì)水解酶活性很高，純化蝮蛇神經(jīng)毒素時(shí)，當(dāng)室溫超過(guò)20℃時(shí)神經(jīng)毒素被水解，可用0.1mol/LEDTA抑制蝮蛇毒中的蛋白水解酶。目前十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)制備過(guò)程一般可分為5個(gè)階段：①材料的選擇和預(yù)處理，②細(xì)胞的破碎（有時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞器的分離），③提取，④純化（包括鹽析，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等），⑤濃縮、干燥及保存。每個(gè)個(gè)案不一定都具備5個(gè)階段，每一階段也不是截然分開的。目前十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.1原料選擇尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官?gòu)闹刑崛〉鞍踪|(zhì)。原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生中選含量高、來(lái)源豐富及成本低的新鮮原料。目前十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)選材要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。若利用蛋白質(zhì)的活性，對(duì)原料的種屬應(yīng)無(wú)影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性，用豬或牛胰臟均可。目前十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)若研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時(shí)，原料的來(lái)源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質(zhì)時(shí)，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料。可能時(shí)盡量用全年均可采到的原料。對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)間的差異（如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對(duì)減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。目前十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.2前處理4.1.2.1細(xì)胞的破碎動(dòng)物材料要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。除提取胞細(xì)外成分，對(duì)細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。目前二十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)①機(jī)械方法：通過(guò)機(jī)械切力作用使組織細(xì)胞破壞。高速組織搗碎機(jī)宜用于植物組織和動(dòng)物內(nèi)臟組織的破碎；小量的樣品也可用研缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱導(dǎo)致變性或pH顯著變化。目前二十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)②物理方法：主要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。反復(fù)凍融法：于-15～-20℃冰凍，然后緩慢融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水結(jié)凍，冰晶將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶解，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。目前二十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)冷熱變替法：將材料投入沸水中，于90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。超聲波法：暴露于9～10千周聲波或10～500千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。加壓破碎法：一定氣壓或水壓也可使細(xì)胞破碎。目前二十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③化學(xué)方法有機(jī)溶媒法：粉碎后的材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性。表面活性劑處理：SDS、氯化十二烷基吡啶及去氧膽酸鈉等。目前二十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)④生物化學(xué)方法自溶法：將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。自體融解過(guò)程中pH會(huì)變化，隨時(shí)調(diào)節(jié)pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。目前二十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)酶法：用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。溶菌酶用于細(xì)菌菌體的裂解。例如，1g菌體加1～10mg溶菌酶，在pH6.2～7.0下，1h可完全溶菌。蝸牛酶及纖維素酶常用于破壞植物細(xì)胞。目前二十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶性的形式存在于體液（如血漿）中，可不經(jīng)過(guò)破碎直接進(jìn)行分離。目前二十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.2.2細(xì)胞器的分離為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，對(duì)于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA則大部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一定位置。目前二十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)、酶及核酸在肝細(xì)胞內(nèi)分布情況目前二十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器分離制備的介質(zhì)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。目前三十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的提取細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來(lái)，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，用適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘碾s質(zhì)，如脂類、糖類及其他可溶性蛋白質(zhì)，剩下就是不溶性蛋白質(zhì)。目前三十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)①水溶液提取大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提，用適當(dāng)?shù)南←}溶液或緩沖液提取，可增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及溶解度。目前三十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)②鹽溶液提取以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個(gè)因素。鹽濃度等滲鹽溶液常用0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液，以及0.15mol/L氯化鈉溶液。例如，用0.1mol/L碳酸氫鈉提取6-磷酸葡萄糖脫氫酶等。目前三十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)有時(shí)為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，常用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下溶解度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L以上氯化鈉提取。目前三十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及pH即可提取與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的水溶性蛋白。某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的蛋白，需用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。例如，脂蛋白可用稀的去垢劑（SDS、洋地黃皂苷）或有機(jī)溶劑抽提。其它不溶于水的蛋白質(zhì)通常用稀堿溶液抽提。目前三十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)pH值提取液的pH值應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度。如細(xì)胞色素C屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提?。患∪飧视腿?3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取。某些蛋白與其它物質(zhì)以離子鍵結(jié)合，選擇pH3～6的提取液有利于分離提取。目前三十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)溫度多數(shù)酶的提取溫度＜4℃。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進(jìn)一步純化。如胃蛋白酶等及一些多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取。提取酶時(shí)加入底物或輔酶，改變酶分子表面電荷分布，能提高提取效果。目前三十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③有機(jī)溶劑提取用有機(jī)溶劑提取蛋白的情況較少。一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從線粒體和微粒體等含脂質(zhì)較多的原料中提取蛋白時(shí)，采用丁醇提取效果較好。目前三十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水能溶解10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力增加。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度-2℃至40℃）。用丁醇曾成功提取琥珀酸脫氫酶、堿性磷酸脂酶等。目前三十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60～70%的酸性乙醇提取，一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對(duì)胰島素的破壞，同時(shí)也達(dá)到大量除去雜蛋白的目的。目前四十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)④表面活性劑的利用與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)，采用表面活性劑如膽酸鹽及SDS等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽(yáng)離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（TritonX-100、TirtonX-114、吐溫-60及吐溫-80）等。非離子型表面活性劑較溫和，不易引起酶失活。目前四十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)⑤對(duì)提取物的保護(hù)細(xì)胞中普遍存在蛋白酶，多數(shù)蛋白酶的最適pH在3～5或更高。因此，一般采用低溫和較低的pH，可降低蛋白酶引起水解程度。低pH也可使許多酶原在提取中不被激活，不表現(xiàn)水解活力。目前四十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白酶抑制劑也可起保護(hù)作用，用二異丙基氟磷酸抑制以絲氨酸為活性中心的酶，用對(duì)氯汞苯甲酸抑制以巰基為中心的酶等。提取溶液中加有機(jī)溶劑時(shí)也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白酶的性質(zhì)變化很大，應(yīng)根據(jù)具體對(duì)象而變化。目前四十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)一些含巰基的蛋白，這些巰基可能是活性所必需。提取時(shí)應(yīng)避免金屬離子和氧化劑。一般可在提取液中加金屬螯合劑（如EDTA）以及還原劑（抗壞血酸）。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價(jià)鍵結(jié)合的配基。提取時(shí)要注意保護(hù)，不要使配基丟失。目前四十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.4蛋白質(zhì)的粗分離從破碎材料或細(xì)胞器提出的蛋白質(zhì)需進(jìn)一步分離純化。純化包括將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各種不同的蛋白質(zhì)分開。選擇提取條件時(shí)，就要考慮盡量除去非蛋白質(zhì)。有些雜質(zhì)，如脂肪應(yīng)首先除去，可用有機(jī)溶劑除去。目前四十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)提取蛋白中混有的核酸或多糖，可用專一性酶水解，有機(jī)溶劑抽取及選擇性部分沉淀等方法處理。小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程中通過(guò)多次液相與固相轉(zhuǎn)化中被分離或最后用透析法除去。目前四十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)對(duì)同類物質(zhì)如酶與雜蛋白、RNA、DNA以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間的分離，主要采用鹽析、有機(jī)溶劑沉淀，等電點(diǎn)沉淀、吸附、結(jié)晶、電泳、超離心及柱層析等方法。鹽析法、等電點(diǎn)法及結(jié)晶法用于蛋白質(zhì)和酶的提純；有機(jī)溶劑抽提和沉淀多用于核酸提純；柱層析和梯度離心廣泛應(yīng)用于蛋白和核酸的提純。目前四十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的分離純化較難，而其本身的性質(zhì)又限制了某些方法的使用，因此要根據(jù)其微細(xì)特征，如分子形狀、分子量大小、電離性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等。巧妙的聯(lián)用各種方法并進(jìn)行嚴(yán)密的操作。目前四十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)同時(shí)應(yīng)掌握純化過(guò)程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白質(zhì)可利用其比活力增加為尺度進(jìn)行追蹤。其他蛋白質(zhì)可用電泳、超離心、層析、擴(kuò)散及溶解等測(cè)定純度。目前四十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)除去蛋白質(zhì)提取液中雜質(zhì)的方法①核酸沉淀法：用氯化錳、魚精蛋白硫酸鹽等沉淀劑使其沉淀而除去。也可用核酸酶將核酸降解后除去。即在粗勻漿中加入少量DNase，4℃保溫30～60min，可使DNA降解。②醋酸鉛沉淀法：用醋酸鉛沉淀除去雜蛋白，當(dāng)然，目的蛋白也會(huì)緩慢變性，因此應(yīng)迅速進(jìn)行透析除去醋酸鉛。目前五十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③調(diào)pH值或加熱沉淀法：利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)的熱變性的溫度系數(shù)差異，可在一定的pH下將蛋白提取液加熱到一定的溫度，使對(duì)熱不穩(wěn)定的雜蛋白性沉淀而除去。目前五十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)④選擇性變性法：利用各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，可用選擇性變性法來(lái)除去雜蛋白。例如胰蛋白酶及細(xì)胞色素C等少數(shù)特別穩(wěn)定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸處理，此時(shí)其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白酶和細(xì)胞色素C則仍留在溶液中。⑤透析法：小分子物質(zhì)可透析除去。目前五十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)提取液通過(guò)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、結(jié)晶和等電點(diǎn)沉淀方法可獲得較粗產(chǎn)品，若要得到精制的產(chǎn)品還需要進(jìn)一步純化。目前五十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.4.1鹽析法分離蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)和酶的提純過(guò)程中，一般粗抽提物常用鹽析法進(jìn)行粗分，也可反復(fù)用鹽析法純化蛋白。蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加（鹽溶，與離子強(qiáng)度0～1間成比例增加）。當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析，離子強(qiáng)度2～10）。目前五十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間電荷基團(tuán)的靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀析出。鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達(dá)到彼此分離的方法。目前五十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)在某一鹽溶液中鹽析效果與鹽的性質(zhì)（鹽離子價(jià)數(shù)和平均半徑）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。蛋白質(zhì)是具有許多親水基團(tuán)的偶極離子，常需用要較高的離子強(qiáng)度才能從溶液中析出。一般可在一定的pH和溫度下改變離子強(qiáng)度，或在一定離子強(qiáng)度下改變pH及溫度，進(jìn)行分段鹽析法，將不同的蛋白組分先后析出，達(dá)到分離的目的。目前五十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)鹽的選擇蛋白質(zhì)在水中溶解度取決于蛋白質(zhì)分子上離子基團(tuán)周圍的水分子數(shù)目，即蛋白質(zhì)的水合程度。因此，控制水合程度也就是控制蛋白質(zhì)的溶解度。加入中性鹽可控制蛋白質(zhì)的水合程度，例如用硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨。目前五十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)硫酸銨具有溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時(shí)飽滿和溶解度為4.1mol，即767g/l；0℃時(shí)飽滿和溶解度為3.9mol，即676g/l）的優(yōu)點(diǎn)。在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)均可鹽析出來(lái)，且硫酸銨價(jià)廉易得，分段效果較其它鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。目前五十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)硫酸銨對(duì)蛋白氮的測(cè)定有干擾，緩沖能力較差，有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，硫酸鈉的缺點(diǎn)是30℃以下溶解度太低。磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但溶解度低，受溫度影響大。氯化鈉的溶解度不如硫酸銨，但在不同溫度下它的溶解度變化不大。目前五十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)硫酸銨濃溶液的pH常在4.5～5.5之間，純度不高的硫酸銨還常含有少量游離硫酸，pH值往往降至4.5以下，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。目前六十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)在分段鹽析時(shí)，加鹽濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度為100%。用硫酸銨鹽析時(shí)其溶液飽和度調(diào)整方法有3種。①加入飽和溶液法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大所需調(diào)整的濃度不高時(shí)，加入飽和硫酸銨溶液。目前六十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)配制法：加入過(guò)量硫酸銨，熱至50～60℃保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再于0℃或25℃下平衡1～2天，有固體析出時(shí)即達(dá)100%飽和度。鹽析所需飽和度計(jì)算：V=V0(S2-S1)/(1-S2)式中V:所需加入飽和硫酸銨溶液的體積V0：待鹽析溶液的體積S1：待鹽析溶液的原始飽和度S2

：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度目前六十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)②加入固體鹽法：當(dāng)鹽析所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又不再過(guò)分增大時(shí)，可直接加固體硫酸銨，在25℃及0℃時(shí)所需硫酸銨飽和度可查表。目前六十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③透析平衡法：將鹽析的樣品液裝于透析袋內(nèi)，浸入飽和硫酸銨溶液中進(jìn)行透析，外部的硫酸銨不斷擴(kuò)散進(jìn)入透析袋內(nèi)，此法濃度變化較連續(xù)，不會(huì)出現(xiàn)鹽的局部過(guò)高現(xiàn)象，但鹽析時(shí)測(cè)定鹽的飽和度手續(xù)較繁，運(yùn)用較少。目前六十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)確定沉淀蛋白質(zhì)所需硫酸銨濃度的方法將少量樣品冷卻到0～5℃，然后攪拌加入固體硫酸銨粉末，見蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀時(shí)，離心除去沉淀，分析上清液確定所要蛋白質(zhì)的濃度，如它仍在溶液中則棄去沉淀，再加更多的硫酸銨于上清液中，直到產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀時(shí)止。以所要提取的蛋白質(zhì)在溶液中的濃度對(duì)硫酸銨濃度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質(zhì)開始沉淀的濃度。如不考慮收率，飽和度區(qū)間可取得窄一些，使純度高一些。目前六十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)鹽析時(shí)注意的問題鹽的飽和度：不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組成的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋白沉淀進(jìn)行離心或過(guò)濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第2種蛋白質(zhì)沉淀。目前六十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)飽和度達(dá)20%時(shí)，纖維蛋白原首先析出；飽和增至28～33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33～50%時(shí)，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)清蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液中分離得到9種以上蛋白質(zhì)及酶。目前六十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)pH值：在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小易沉淀析出。因此鹽析時(shí)除個(gè)別特殊情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。由于硫酸銨有弱酸性，它的飽和溶液的pH值低于7，如所要蛋白質(zhì)遇酸易變性則應(yīng)在適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行。目前六十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下蛋白質(zhì)濃度愈高愈易沉淀。使用鹽的飽和度的極限也愈低。如血清球蛋白的濃度從0.5%增至3.0%時(shí)，需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%。目前六十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)進(jìn)行兩次鹽析，可提高分離純度。較高濃度的蛋白質(zhì)雖然對(duì)沉淀有利，但濃度過(guò)高也易引起雜蛋白的共沉作用。因此，必須選擇適當(dāng)濃度盡可能避免共沉作用的干擾。一般2.5%~3.0%的蛋白濃度比較適中。目前七十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)溫度：由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有一定保護(hù)作用，鹽析操作一般可在室溫下進(jìn)行。至于某些對(duì)熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質(zhì)鹽析時(shí)對(duì)溫度要求不太嚴(yán)格。但在中性鹽中結(jié)晶純化時(shí)，溫度影響則比較明顯。目前七十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)脫鹽：蛋白質(zhì)用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。常用透析法脫鹽，透析法所需時(shí)間較長(zhǎng)，常在低溫下進(jìn)行并加入防腐劑避免微生物污染。也可用分子篩層析，常用SephadexG-25柱層析法，上樣不要超過(guò)床體積的20%。目前七十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)有些金屬離子能和蛋白質(zhì)形成較為專一的結(jié)合而使蛋白質(zhì)沉淀。這不是典型的鹽析，但在制備蛋白質(zhì)中也有應(yīng)用。例如，鋅離子在特定pH下與胰島素結(jié)合形成沉淀。目前七十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)從懸浮液中沉淀出來(lái)的速度極慢，鹽析后一般放置0.5～1h，待沉淀完全后再分離，低濃度的鹽析后固液分離一般用離心法，高濃度的溶液常用過(guò)濾法。目前七十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.4.2有機(jī)溶劑分離蛋白質(zhì)有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低。有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。目前七十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)常用的有機(jī)溶劑有乙醇和丙酮，由于有機(jī)溶劑的加入易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一般宜在低溫下進(jìn)行，且在加入有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過(guò)大。目前七十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)有機(jī)溶劑沉淀一般比鹽析法易過(guò)濾或離心沉降。分離后的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑的濃度。操作時(shí)的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性和提高分離的效果。目前七十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)一般在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)添加中性鹽的濃度在0.05mol左右，過(guò)多不僅耗費(fèi)有機(jī)溶劑，而且可能導(dǎo)致沉淀不好。沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴(yán)格控制，才能得到重復(fù)性結(jié)果。有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度表示，故操作條件比鹽析法嚴(yán)格。目前七十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.4.3蛋白質(zhì)的結(jié)晶影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素很多，一般包括①pH值：與沉淀蛋白質(zhì)原理相同，結(jié)晶的溶液pH值一般選擇在被結(jié)晶的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，以利于晶體的析出。②溫度：除少數(shù)情況外，通常在低溫條件下進(jìn)行。低溫使蛋白質(zhì)溶解度低且不易變性。在中性鹽溶液中結(jié)晶時(shí)可在0℃至室溫范圍內(nèi)選擇，在有機(jī)溶劑中結(jié)晶要求溫度較低。目前七十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③晶種：不易結(jié)晶蛋白質(zhì)和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結(jié)晶可導(dǎo)致大量結(jié)晶的形成。有時(shí)用玻璃輕輕摩擦容器壁也可達(dá)到此目的。需加晶種才能形成結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶，大多數(shù)結(jié)晶收率都不高。目前八十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)利用成核劑（nucleant）使蛋白質(zhì)分子附著其上并形成一個(gè)晶格（crystallattice）。然后，使用一種由鈣、磷酸和硅制成的多孔材料Bioglass（生物玻璃）作為支架讓晶體在其上生長(zhǎng)。找到好的成核劑是獲得好結(jié)晶的關(guān)鍵。目前八十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)④金屬離子：有些蛋白結(jié)晶時(shí)需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸銨溶液中結(jié)晶時(shí)，加入少量鎘離子才形成菱狀結(jié)晶，烯醇化酶常加入汞鹽后形成結(jié)晶。目前八十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)⑤結(jié)晶時(shí)間：在結(jié)晶條件適合的情況下，在幾小時(shí)即可獲得結(jié)晶。但有些情況需數(shù)天甚至數(shù)月才能結(jié)晶完全。蛋白質(zhì)的結(jié)晶大多數(shù)是針狀、棒狀、片狀，有的為八面體或立方體的菱狀結(jié)晶。結(jié)晶的大小與結(jié)晶時(shí)間及條件有關(guān)。目前八十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)Thehangingdroptechnique目前八十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.4.4蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。目前八十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)的純化純化包括將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開，將各種不同的蛋白質(zhì)分開。4.1.5.1根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小分離純化①凝膠過(guò)濾②SDS③超濾④超速離心目前八十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.5.2根據(jù)電荷差異分離純化①離子交換層析②PAGE③等電聚焦目前八十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.5.3根據(jù)分子極性差異①反相色譜②鹽析③疏水層析目前八十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)等生物大分子的表面常暴露一些疏水性基團(tuán)（稱為疏水補(bǔ)丁），在高鹽濃度下，這些疏水補(bǔ)丁可與疏水性層析介質(zhì)相互作用而結(jié)合。洗脫時(shí)將鹽濃度逐漸降低，蛋白質(zhì)因疏水性不同而逐個(gè)地先后被洗脫而純化。此法能分離其它一些方法不易純化的蛋白質(zhì)。目前八十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)Phenyl-Sepharose是以交聯(lián)瓊脂糖為支持物，其上共價(jià)結(jié)合苯基為疏水性配體，可與疏水性物質(zhì)發(fā)生疏水作用。目前九十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.5.4根據(jù)親和性差異親和層析目前九十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.6濃縮、干燥及保存4.1.6.1樣品的濃縮生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。①蒸發(fā)濃縮：減壓蒸發(fā)濃縮。②冰凍法：操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，不含蛋白質(zhì)的純冰浮于液面，蛋白質(zhì)則集中于溶液中，移去冰塊，可得蛋白質(zhì)的濃縮液。目前九十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③吸收法：通過(guò)吸收劑（聚乙二醇，聚乙稀吡咯烷酮、蔗糖和凝膠等）直接收除去溶液中水使之濃縮。使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將溶液裝入透析袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4℃下，袋內(nèi)水滲出即被聚乙二醇迅速吸去。④超濾法目前九十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.6.2干燥蛋白質(zhì)干燥方法有噴霧干燥、氣流干燥和真空冷凍干燥法等。真空冷凍干燥適用于不耐高溫和易氧化物質(zhì)的干燥和保存。在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍結(jié)冰，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。干后的產(chǎn)品疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)，適用于各類生物大分子的干燥保存。目前九十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.6.3貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。蛋白質(zhì)貯藏應(yīng)避免長(zhǎng)期暴露于空氣中防止微生物的污染。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)月甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)密封，保持0～4℃即可。目前九十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)液態(tài)貯藏的優(yōu)點(diǎn)是使樣品免去干燥步驟，生物大分子的生理活性和結(jié)構(gòu)破壞較少；缺點(diǎn)是需要較嚴(yán)格的防腐措施，貯藏時(shí)間不能太長(zhǎng)，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意①樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。目前九十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)②一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨、蔗糖、甘油等，酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。③貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0℃左右保存，有的則要求更低。有些蛋白質(zhì)在低溫中反而引起變性。目前九十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.1.7蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)純化后需要一定的指標(biāo)說(shuō)明其純度，其實(shí)許多制備純化蛋白的方法也可以作為分析方法，如電泳、微量凝膠過(guò)濾法、層析、結(jié)晶、生物活力及免疫分析等。目前九十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)由于蛋白種類繁多，有些性質(zhì)相似，一般需要用兩種以上方法來(lái)分析蛋白的純度。對(duì)蛋白質(zhì)純度的要求因需要而異，生物制品考慮制品體內(nèi)的副作用；物理化學(xué)研究要求不干擾對(duì)象的理化性質(zhì)；化學(xué)結(jié)構(gòu)分析要求雜質(zhì)含量低于分析方法的靈敏度等。目前九十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)確定蛋白質(zhì)樣品純度的標(biāo)準(zhǔn)一般為：分子大小均一，電荷均一，氨基酸組成恒定，具有單一的N末端和C末端殘基，進(jìn)一步純化時(shí)生物活性是否再有提高及能否結(jié)晶等。目前一百頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)以上幾條是較嚴(yán)格的要求，很難全都達(dá)到。通常以電泳時(shí)呈現(xiàn)一條帶以及末端殘基鑒定是單一的即可進(jìn)行順序測(cè)定。從N末端測(cè)順序一般在4步以上，如果都是單一的氨基酸殘基，則含雜質(zhì)可能為十六萬(wàn)分之一。目前一百零一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)隨著分析技術(shù)水平的不斷提高，經(jīng)常還將一種曾認(rèn)為是純的蛋白質(zhì)分離成幾個(gè)組分，即出現(xiàn)微不均一性（Microheterogeneity）的現(xiàn)象。這種不均一性可分為兩類情況。目前一百零二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)一類是在蛋白質(zhì)肽鏈合成后在加工中產(chǎn)生的。如糖蛋白由于含糖量不同，它們的電泳行為常表現(xiàn)很大差異；又如賴氨酸的甲基化，絲氨酸的磷酰化以及磺?；?，也會(huì)產(chǎn)生電泳行為的不均一性；還有一些則是在分離純化過(guò)程中人為產(chǎn)生的，如脫酰氨等，這種不均一性對(duì)蛋白質(zhì)順序分析不會(huì)帶來(lái)太大的困難。目前一百零三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)另一類不均一性是由于基因家族產(chǎn)生的，它們之間的不同表現(xiàn)為個(gè)別氨基酸的替換、N端或C端肽段的缺失等，這種不均一性會(huì)給蛋白質(zhì)分析帶來(lái)很大困難。目前一百零四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)但蛋白質(zhì)分子的一部分分子的一個(gè)側(cè)鏈酰基變成了羧基，糖蛋白的配基相差一個(gè)單糖，這種情況下蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)仍是單元一蛋白質(zhì)，生物功能也無(wú)任何影響。此外還有同功蛋白質(zhì)（Isoprotein），它的功能相同但化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，從功能上看純了從結(jié)構(gòu)上看不純。因此，純度屬相對(duì)的概念，具體情況要多做具體分析，切不可簡(jiǎn)單化。目前一百零五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定凱氏定氮法Folin-酚試劑法（Lowry法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）目前一百零六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)目前一百零七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)一種蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測(cè)定，可能得出不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。目前一百零八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.3蛋白質(zhì)序列測(cè)定蛋白質(zhì)的生物功能歸根結(jié)底是其一級(jí)結(jié)構(gòu)的反映，因此，搞清蛋白質(zhì)的氨基酸序列對(duì)闡明序列與功能的關(guān)系、生物進(jìn)化、遺傳變異等有重要意義。目前一百零九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)蛋白質(zhì)測(cè)序存在兩個(gè)難題：得到高精度純化的蛋白和提純低分子量蛋白。例如，在人類破譯干擾素結(jié)構(gòu)之前的20多年中，很難對(duì)其進(jìn)行純化。目前一百一十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)1955年Sanger用了10年時(shí)間測(cè)定了牛胰島素序列。之后測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)幾十萬(wàn)種蛋白質(zhì)進(jìn)行了序列測(cè)定。4.3.1蛋白質(zhì)測(cè)序策略目前一百一十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)Edman化學(xué)降解法、質(zhì)譜法、根據(jù)核酸序列推測(cè)肽鏈順序、肽鏈條數(shù)判定、二硫鍵斷裂及多肽鏈拆分、分子量測(cè)定、氨基酸組成分析、N-端和C-端殘基測(cè)定、肽鏈的部分裂解和純化、肽段氨基酸序列測(cè)定、肽段次序決定。目前一百一十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.3.2蛋白質(zhì)自動(dòng)序列分析儀1967年Edman推出第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀，測(cè)序儀的發(fā)展以后又經(jīng)歷了液相測(cè)序儀-固相測(cè)序儀-氣相測(cè)序儀的發(fā)展歷程。液相測(cè)序：樣品一直處于溶液狀態(tài)，樣品沒有耦聯(lián)到任何載體上，樣品容易損失。目前一百一十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)固相測(cè)序：將蛋白質(zhì)共價(jià)耦聯(lián)于聚苯乙烯膜，微孔玻珠或PVDF膜上再進(jìn)行序列分析的方法。這樣可避免因沖洗而使樣品損失，同時(shí)在序列降解及沖洗步驟采取較劇烈的條件。目前一百一十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)氣相測(cè)序：蛋白質(zhì)通過(guò)polybrene等載體吸附在化學(xué)惰性的玻璃濾膜上，偶聯(lián)堿和裂解酸以氣相方式轉(zhuǎn)運(yùn)，反應(yīng)副產(chǎn)物和ATZ氨基酸通過(guò)有機(jī)溶劑以氣相方式萃取，蛋白質(zhì)本身不會(huì)丟失。目前一百一十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)目前一百一十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)序列測(cè)試時(shí)應(yīng)注意的問題樣品純度：>90%，鹽含量在50mmol/L內(nèi)，不含變性劑（如SDS)等雜質(zhì)，其N-端必須是均一的高純樣品。例如樣品中含2個(gè)混合物，只有含量相差4～5倍以上才能對(duì)主序列和次序列進(jìn)行分析。純度鑒定方法：質(zhì)譜、SDS、HPLC、HPCE，一般采用2種以上的方法驗(yàn)證。目前一百一十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)樣品量：至少需要10pmol，例如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)定：10pmol樣品可測(cè)定20氨基酸殘基。一般樣品量大于50pmol或者更多測(cè)定序列越長(zhǎng)。如分子量為20kD的蛋白質(zhì)，50pmol約為1g。所以蛋白質(zhì)N-端測(cè)序?qū)儆诔Ｒ?guī)測(cè)定。目前一百一十八頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)樣品存在狀態(tài)液體：液體樣品中不能含有蛋白酶以防降解，同時(shí)樣品測(cè)試前不能放置太久，在－20℃以下保存，最好盡早測(cè)試。轉(zhuǎn)膜樣品：樣品經(jīng)凝膠電泳分離后，應(yīng)馬上進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上面，轉(zhuǎn)膜前不能放置很久以防止樣品擴(kuò)散。含有樣品的PVDF可以用濾紙夾住保持在密封塑料袋中，可以在冰箱保存3～6個(gè)月。目前一百一十九頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)如果樣品沒有任何信號(hào)峰，要考慮蛋白N-端封閉。須經(jīng)蛋白質(zhì)化學(xué)降解或酶切后分離后分析。有時(shí)樣品在分離純化中也會(huì)產(chǎn)生N-端封閉，主要由于溶液中去垢劑或化學(xué)物質(zhì)與蛋白樣品N-端功能基團(tuán)反應(yīng)，或者分離純化中pH過(guò)高（＞9-10）。目前一百二十頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)轉(zhuǎn)膜樣品要求為防止部分蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程被膠內(nèi)雜質(zhì)而封閉Ｎ-末端，請(qǐng)預(yù)先自做預(yù)電泳。即用低電壓跑空膠2～2.5h再上樣電泳分離。電泳過(guò)程中，用盡量避免條帶拖尾現(xiàn)象，用于測(cè)序的條帶用狹窄清晰。而且必須保證一定的量，測(cè)定20個(gè)氨基酸以上的蛋白質(zhì)，至少需要2～3條明亮清晰的條帶。目前一百二十一頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)樣品轉(zhuǎn)膜后請(qǐng)用CoomassieR-250染色1分鐘以內(nèi)，避免使用CoomassieG-250.電泳緩沖液建議使用CAPS（3-環(huán)己胺丙磺酸）緩沖液，不要使用Tris-Gly緩沖液。目前一百二十二頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.4WesternBlotting4.4.1試劑4.4.1.1電泳試劑①30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.0g，甲叉雙丙烯酰胺1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。②1.5mol/LTris-HCl分離膠緩沖液pH8.8（4×）：取18.15gTris，用1MHCl調(diào)pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。目前一百二十三頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)③0.5mol/LTris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8（8×）：取11.96gTris，用1MHCl調(diào)至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。④電極緩沖液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。⑤10%SDS：取10gSDS加水至100ml，完全溶解后室溫保存。目前一百二十四頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)⑥10%過(guò)硫酸銨溶液（AP）：臨用前現(xiàn)配。⑦染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、50%甲醇、7%乙酸）：考馬斯亮藍(lán)R-2502.5g、甲醇（可用無(wú)水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后補(bǔ)足水至總體積1000ml。⑧脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無(wú)水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，補(bǔ)足水至1000ml。目前一百二十五頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)⑨樣品緩沖液（2×）：H2O2.4ml，濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml，β-巰基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚蘭0.2ml。⑩TEMED（四甲基乙二胺）目前一百二十六頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)4.4.4.2轉(zhuǎn)移和雜交試劑①轉(zhuǎn)移緩沖液：3.03gTris、14.4g的Glycine、200ml甲醇、定容到1L。②TBS：0.1M的Tris、0.9%的NaCl、pH7.5③TTBS：TBS中含0.1%的Tween-20④預(yù)染的蛋白marker⑤硝酸纖維素膜目前一百二十七頁(yè)\總數(shù)一百四十五頁(yè)\編于十八點(diǎn)⑥脫脂奶粉⑦anti-