上海市臨檢中心 PCR培訓(xùn)班 臨床分子診斷方法學(xué)驗(yàn)證要求

臨床分子診斷方法學(xué)驗(yàn)證要求關(guān)

明復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科主要內(nèi)容?

什么是驗(yàn)證？自建項(xiàng)目？商業(yè)化項(xiàng)目？?

如何做驗(yàn)證？步驟和實(shí)施路徑?

舉例說明JAK2

V617F突變方法的建立分子診斷面臨的挑戰(zhàn)?

涉及方法較多，如PCR、熒光定量PCR、MLPA、測序等；?

實(shí)驗(yàn)步驟較多，包括標(biāo)本的分離保存、處理、檢測；?

手工程度較高，自動化程度普遍偏低，較多依賴手工，不同的實(shí)驗(yàn)室條件和操作者等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大；?

尚未建立公認(rèn)的質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)等；?

更高的準(zhǔn)確性要求；?

結(jié)果報(bào)告缺乏標(biāo)準(zhǔn)化；?

……這些基地將為個體化醫(yī)學(xué)相關(guān)檢測工作制定國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并面向相關(guān)從業(yè)人員展開規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的培訓(xùn)工作，為我國個體化醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用提供寶貴經(jīng)驗(yàn)，大大加快我國分子診斷的進(jìn)程。CONTENTS?

SUMMARYOF

CHANGES?

UNDERSTANDING

THE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLIST

COMPONENTS?

HOWTOINSPECTUSING

R.O.A.DINSP?

ADDITIONAL

INFORMATION?

APPLICABILITY?

PROFICIENCYTESTING?

QUALITY

MANAGEMENTAND

QUALITYGENERALISSUESPROCEDUREMANUALASSAYVALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMEN

PROCESSINGQUANTITATIVEASSAYS:

CALIBRAREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetectionMethodsAgaroseandPolyacrylamReal-Time

PolymeraseCh“Verification”和“Validation”Verification(確認(rèn)）“通過提供客觀證據(jù)證明特定的要求已得到滿足”?

當(dāng)已經(jīng)存在合適的性能參數(shù)時(shí)候，有必要明確在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)新的試驗(yàn)符合參數(shù)規(guī)定，這個過程叫確認(rèn)。?

正確地做某個試驗(yàn)（

thetestisbeing

performed

correctly）.?

其他確認(rèn)的應(yīng)用包括：采用某個實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的技術(shù)開展新試驗(yàn)（為一個新的基因測序）；或者開展某個已經(jīng)在其他實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證過試驗(yàn)?！癡erification”和“Validation”Validation(驗(yàn)證)“通過提供客觀證據(jù)證明預(yù)期的使用或應(yīng)用要求已得到滿足”?

當(dāng)沒有合適的性能參數(shù)可供參考時(shí)需要驗(yàn)證。?

與”金標(biāo)準(zhǔn)“和參考試驗(yàn)相比較去評估性能?

做正確的試驗(yàn)（performingthe

correcttest)?

在醫(yī)學(xué)分子診斷領(lǐng)域，由于往往缺乏參考方法或者參考物質(zhì)，通常將最可靠的方法作為標(biāo)準(zhǔn)。不同認(rèn)可體系對方法學(xué)驗(yàn)證的要求?

CAP的“方法學(xué)驗(yàn)證（assay

validation）”和ISO15189中的“診斷性驗(yàn)證（diagnostic

validation）”?

共同點(diǎn)：新的檢測方法應(yīng)用到病人臨床診斷之前必須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以了解該檢測的臨床表現(xiàn)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度[1-3]。?

CAP提出了明確的要求：“實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行分析驗(yàn)證各項(xiàng)檢測的性能參數(shù)”，還對驗(yàn)證試驗(yàn)覆蓋的標(biāo)本范圍（如不同的基因型等）、標(biāo)本類型（如血液、尿液、新鮮/冷凍組織、石蠟包埋組織等）、驗(yàn)證的參數(shù)（如參考值、報(bào)告范圍、準(zhǔn)確度、分析靈敏度、分析特異性和精確度等）做了相應(yīng)的規(guī)定。[1]GuzelO,GunerEI.ISO

15189

accreditation:Requirementsforqualityandcompetence

ofmedical

laboratories,experience

ofa

laboratoryI.ClinBiochem,2009,42:

274-278.[6]Yanikkaya-Demirel

G.ISO

15189

accreditation:

Requirementsforqualityandcompetence

ofmedical

laboratories,experience

ofa

laboratoryII.ClinBiochem,2009,42:

279-283.[7]Jennings

L,VanDV,GulleyML.Recommended

principlesandpractices

forvalidatingclinicalmolecular

pathology

tests.ArchPathol

LabMed,2009,133:

743-755.方法學(xué)驗(yàn)證的要求的修正和改進(jìn)IVDs.AndLDTs.?

Invitrodiagnostics(IVDs):商業(yè)化生產(chǎn)試劑盒；通過FDA510(k)

clearanceorPMA(premarketapproval)。?

Laboratory-developedtests(LDTs):

自建項(xiàng)目；局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。?

ManyoftheseclinicallyimportantLDTsareunlikelytoeverbecomeFDAclearedorapprovedbecauselow

test

volumesmakeiteconomicallyunfeasibletogothroughtheFDA

cleared:

In

vitro

diagnostics

that

have

gone

through

and

passed

a

510(k)

trial.FDA

approved:

AnIVDthat

has

gone

through

and

passed

aPMA

trial.510(k)

trials

are

designed

to

show

that

an

IVDissubstantially

equivalent

to

alegally

marketedpredicate

device.

510(k)

trials

are

less

involved

and

less

expensive

than

PMA

trials.???currentFDA510(k)

or

PMAapprovalprocess.?Premarket

approval

trials

are

required

for

class

III

medical

devices

or

ifthere

isno

predicate

deviceavailable

for

comparison.

They

are

significantly

more

expensive

to

perform

than

510(k)

trials.Verification/確認(rèn)試驗(yàn)?

使用范圍：主要用于商業(yè)化試劑盒（in

vitro

diagnostics，IVDs）項(xiàng)目，指已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，并已經(jīng)通過美國FDA510(k)

clearance

或approval過程的分子診斷項(xiàng)目。?

主要目的：確證廠家提供的數(shù)據(jù)在本實(shí)驗(yàn)室的的實(shí)際效果?

主要指標(biāo)：準(zhǔn)確性、精確性、參考范圍和可報(bào)告范圍（這些指標(biāo)通常在廠商的說明書中提及）。PARR(precision,accuracy,reportablerange,andreferencerange).Validation/驗(yàn)證試驗(yàn)?

使用范圍：自建項(xiàng)目（LDTs）和修改項(xiàng)目

（modifiedFDA-cleared/approvedtests）?

主要目的：驗(yàn)證本試驗(yàn)在臨床使用的各項(xiàng)性能指標(biāo)及其實(shí)際效果?

主要指標(biāo)：準(zhǔn)確性、精確性、參考范圍和可以接受范圍（與確證實(shí)驗(yàn)要求相同）分析敏感性、分析特異性（驗(yàn)證試驗(yàn)要求）其他涉及的重要的評價(jià)指標(biāo)（標(biāo)本穩(wěn)定性、干擾物質(zhì)、線性……）（驗(yàn)證試驗(yàn)要求）?

與確診試驗(yàn)相比相對復(fù)雜PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)和其他涉及的重要的臨床評價(jià)指標(biāo)Clinical

validity/臨床驗(yàn)證?

主要包括：臨床敏感性（clinical

sensitivity）和臨床特異性（clinicalspecificity)

。?

臨床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指參考方法檢測結(jié)果為陽性的結(jié)果中，用實(shí)驗(yàn)方法得到陽性結(jié)果的一致性（對定性試驗(yàn)來說）；臨床敏感性主要指結(jié)果為真陽性的人群中真正罹患某種疾病或異常的比例，強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷的一致性。?

臨床特異性也不同于分析特異性：分析特異性主要指參考方法檢測結(jié)果為陰性的結(jié)果中，用實(shí)驗(yàn)方法得到陰性結(jié)果的一致性（對定性試驗(yàn)來說）；臨床特異性主要指實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性的人群中真正沒有罹患某種疾病或異常的比例，也強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床診斷的一致性。如果是定量實(shí)驗(yàn)，則分析敏感性的定義接近于最低檢測濃度的概念。?

某些罕見的疾病，由于陽性病例的數(shù)量有限，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床敏感性評價(jià)存有一定難度，這時(shí)可以引用文獻(xiàn)報(bào)道的臨床敏感性和特異性作為理論支撐。?

臨床特異性：正常對照容易收集，故容易實(shí)現(xiàn)。實(shí)施具體路徑指南？?

CAP還是ISO15189都沒有提供醫(yī)學(xué)分子診斷驗(yàn)證試驗(yàn)的具體細(xì)節(jié)

。?

臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinical

and

LaboratoryStandardsInstitute,CLSI）的EP文件就對實(shí)驗(yàn)室的分子診斷的方法學(xué)驗(yàn)證做出了說明

。?

臨床分子診斷的歐洲標(biāo)準(zhǔn)化工作組Eurogentest也建立了一些相應(yīng)的指南。開展新試驗(yàn)驗(yàn)證確認(rèn)定義性能參數(shù)：準(zhǔn)確性、缺點(diǎn)、質(zhì)量控制與現(xiàn)有的性能規(guī)范作比較持續(xù)的驗(yàn)證與性能規(guī)范比較、審計(jì)方法學(xué)驗(yàn)證的基本步驟?

第一步:

方法學(xué)驗(yàn)證設(shè)計(jì)階段?

第二步:

具體實(shí)施，搜集數(shù)據(jù)階段?

第三步：補(bǔ)充和完善階段第一步:

方法學(xué)驗(yàn)證設(shè)計(jì)階段運(yùn)籌于帷幄之中，決勝于千里之外！主要內(nèi)容?

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，包括文獻(xiàn)報(bào)道以及相關(guān)疾病的臨床診治指南等，對該檢測的技術(shù)背景進(jìn)行分析；?

明確項(xiàng)目的用途；?

選擇實(shí)驗(yàn)的對照方法；?

具體的實(shí)驗(yàn)步驟、檢測的位點(diǎn)（如可能的突變類型）；?

閾值的選擇；?

質(zhì)控標(biāo)本的選擇（陽性標(biāo)本、陰性對照等)；?

驗(yàn)證試驗(yàn)的臨床標(biāo)本類型以及采集拒收原則；?

實(shí)驗(yàn)室對現(xiàn)儀器和試劑的需求和損耗的評估；?

總的試驗(yàn)和手工處理的時(shí)間的評估；?

試劑儲備的評估；?

其他技術(shù)準(zhǔn)入的評估等。--For

anFDA-approved

test：?

相對簡單?

闡明檢測的應(yīng)用范圍以及預(yù)期觀察的指標(biāo)--ForanLDT

ormodifiedFDA-approved

test：?

相對復(fù)雜?

臨床應(yīng)用價(jià)值（臨床采用該檢測的價(jià)值和危險(xiǎn)）?

臨床指征（盡可能涵蓋所有適合采用該檢測的臨床指征）?

仔細(xì)評價(jià)文獻(xiàn)報(bào)道決定臨床使用價(jià)值：特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室對該檢測知之甚少或者在臨床診斷實(shí)踐中缺乏足夠先例

。其他因素----分析前和分析后因素?

檢測目的

(如篩選、診斷、預(yù)后、預(yù)測、監(jiān)測、確診……）?

標(biāo)本類型

(全血、血清、血漿、尿液…..)?

標(biāo)本采集和處理程序?

拒收原則?

目標(biāo)人群?

結(jié)果評價(jià)?

……----和臨床醫(yī)生的溝通（特別可能會采用該試驗(yàn)的臨床醫(yī)生）?

決定臨床是否感興趣并準(zhǔn)備開展?

決定試驗(yàn)結(jié)果如何影響病人診療?

保證試驗(yàn)方法的選擇來滿足檢測目的?

……----臨床方面：?

錯誤的結(jié)果對病人可能造成的危險(xiǎn)?

快速TAT時(shí)間的要求（特別是該試驗(yàn)時(shí)間對病人的診斷治療產(chǎn)生關(guān)鍵性作用時(shí)）?

是否有確認(rèn)試驗(yàn)?

……-----實(shí)驗(yàn)室方面：?

對現(xiàn)儀器和試劑的需求和損耗的評估?

總的試驗(yàn)和手工處理的時(shí)間的評估?

試劑儲備的評估?

其他技術(shù)準(zhǔn)入的評估?

質(zhì)控品的評估?

……第二步:

具體實(shí)施，搜集數(shù)據(jù)階段定性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)PARR(precision,accuracy,reportablerange,andreferencerange).?

準(zhǔn)確性：與參考方法的陽性和陰性一致性?

精確性：即重復(fù)性，同一些樣本的反復(fù)檢測（批內(nèi)、批間、不同檢測者之間，不同儀器之間等）?

一系列的臨床標(biāo)本，盡可能覆蓋可報(bào)告范圍，和對比方法（如測序等）比對結(jié)果。?

或者用另一個通過驗(yàn)證過程的實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)本進(jìn)行對比結(jié)果。?

CLSI（EP12-A35)推薦至少在10-20天內(nèi)檢測

50個陽性標(biāo)本和50個陰性標(biāo)本。其中一些標(biāo)本還用來計(jì)算重復(fù)性。定量確認(rèn)實(shí)驗(yàn)?

準(zhǔn)確性PARR?

分析檢測范圍?

可報(bào)告范圍?

線性(EP6-A)?

最低檢測限(EP17-A)?

最低定量限?

干擾物質(zhì)

(EP7-A2)?

……(precision,accuracy,reportablerange,

andreferencerange).定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?

基本方法同定性確證實(shí)驗(yàn)?

干擾物質(zhì)評價(jià)?

臨床表現(xiàn)評價(jià)：----診斷已知的情況下，檢測的結(jié)果可以直接用于計(jì)算臨床敏感性和特異性，以及其他一些參數(shù)

。----診斷未知的情況下，可通過文獻(xiàn)報(bào)道和其他外延的方式（如chartreviews

）實(shí)現(xiàn)。PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)定量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?

基本方法同定量確證實(shí)驗(yàn)?

干擾物質(zhì)?

延長檢測天數(shù)至20天，以便于獲得雙倍的數(shù)據(jù)用于分析

(符合EP5-A238和EP09-A237的最低要求)。?

尚未包括其他的參數(shù)，如臨床敏感性和特異性,可通過文獻(xiàn)報(bào)道和其他外延的方式（如chartreviews

）。PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)‘‘確證/驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，究竟多少的標(biāo)本能滿足實(shí)驗(yàn)的需求?’’Itdepends

！第三步:

補(bǔ)充階段補(bǔ)充內(nèi)容

Checklist?

驗(yàn)證總結(jié)完成交主任審核同意?

生物安全內(nèi)容的更新?

標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的撰寫和審核?

必要的worksheets的撰寫和審核?

培訓(xùn)計(jì)劃更新?

員工操作培訓(xùn)?

員工崗位職責(zé)的補(bǔ)充?

儀器維護(hù)的日程更新（如有必要）?

新儀器的性能驗(yàn)證（如有必要）?

信息系統(tǒng)的項(xiàng)目更新?

標(biāo)本接收流程的更新?

標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)的更新?

臨床醫(yī)生的告知?

能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的計(jì)劃?

……驗(yàn)證的持續(xù)性?

當(dāng)某個新試驗(yàn)通過驗(yàn)證，開始在臨床使用——這不是性能評估的終點(diǎn)。?

驗(yàn)證中的性能參數(shù)應(yīng)被用來評估每批試驗(yàn)的有效性，每隔一段時(shí)間，這些信息可以用來加入驗(yàn)證檔案。?

許多時(shí)候，數(shù)據(jù)的積累是最初驗(yàn)證數(shù)據(jù)的重要的組成部分，可以用來持續(xù)性評估監(jiān)測的準(zhǔn)確性和質(zhì)量。?

持續(xù)性的驗(yàn)證可以包括室內(nèi)質(zhì)控，外部室間質(zhì)評和有關(guān)該試驗(yàn)結(jié)果不一致性。什么時(shí)候需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證？?

新項(xiàng)目開展之前；?

新增或者變更原有項(xiàng)目的檢測儀器；?

更換不同廠商提供的試劑；?

同一檢測項(xiàng)目在不同儀器檢測結(jié)果需要修正時(shí)等等。?

不同的驗(yàn)證目的所觀察的性能指標(biāo)各有不同，?

以新項(xiàng)目開展之前的方法學(xué)驗(yàn)證最為重要且全面。?

為了確保在臨床檢測的過程中的分析性能穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠、可追溯，從而保證檢測結(jié)果的有效性。新方法的建立新儀器使用之前更換不同的試劑熒光PCR結(jié)合熔解曲線法檢測JAK2V617F突變方法的建立及其方法學(xué)驗(yàn)證背景介紹?

有多個國內(nèi)外研究課題組證實(shí)，JAK2

V617F（Val617Phe）1849G>T點(diǎn)突變存在于95%的真性紅細(xì)胞增多癥（PV）患者、50%～60%的原發(fā)性血小板增多癥（ET）以及原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）患者體內(nèi)。?

2008年世界衛(wèi)生組織將JAK2V617F突變納入了PV、PT和PMF的診斷標(biāo)準(zhǔn)。?

JAK2

V617F

突變檢測已經(jīng)成為診斷BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤（MPN）的主要分子標(biāo)志物。2008

WorldHealthOrganization

DiagnosticCriteriaforPolycythemiaVera真性紅細(xì)胞增多癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)2008WorldHealthOrganizationDiagnosticCriteria

forEssential

Thrombocythemia原發(fā)性血小板增多癥診斷標(biāo)準(zhǔn)2008

WorldHealthOrganizationDiagnosticCriteriaforPrimaryMyelofibrosis原發(fā)性骨髓纖維化的診斷標(biāo)準(zhǔn)檢測手段?

測序法：金標(biāo)準(zhǔn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?

熒光PCR結(jié)合熔解曲線法[1]：快速、高效，無商業(yè)化臨床試劑盒。?

為了滿足臨床需求，在將熒光PCR結(jié)合熔解曲線法應(yīng)用到患者臨床診斷之前，必須要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，即驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（validation）[2]。??參考文獻(xiàn)：1.張心菊，顧小葉，劉雙春等

采用熒光定量PCR檢測JAK2基因V617F突變

中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2009年5月第32卷第5期583-586.?2.

關(guān)明，劉維薇

CAP和ISO15189認(rèn)可對臨床分子診斷方法學(xué)驗(yàn)證的要求

中華檢驗(yàn)雜志2013年2月第36卷第二期105-107.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?

對象：華山醫(yī)院血液科門診或住院患者中確診的MPN患者57例。其中PV患者33例（外周血31例，骨髓2例），PT患者17例（外周血15例，骨髓2例），骨髓纖維化患者7例（外周血6例，骨髓1例）。同時(shí)收錄對照組51例健康人。標(biāo)本的選擇中涵蓋了5份骨髓液及52份外周血。?

質(zhì)控標(biāo)本的選擇：人紅白血病HEL細(xì)胞作為純合突變型（TT）人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞作為野生型（GG）將兩者混合得到的標(biāo)本作為雜合型（GT）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?

實(shí)驗(yàn)方法

:熒光定量PCR結(jié)合熔解溫度反應(yīng)方法設(shè)計(jì)4條引物針對JAK2野生型和突變型DNA片段。由于野生型和突變型的堿基序列迥異，使得這兩個片段的熔解溫度（Tm)不同。通過對野生型和突變型不同的特異Tm峰就可以判斷JAK2

V617F基因型。?

無突變標(biāo)本在（75.2±0.2）℃處有1個特異Tm峰，有JAK2V617F突變的標(biāo)本則在（76.8±0.2）℃處有1個特異Tm峰（見圖）。?

通過突變型和野生型之間不同Tm值的峰圖可以判斷JAK2V617F的基因型。53驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?

主要評價(jià)指標(biāo)：PARR+AS+ASPARR：精確性（precision）準(zhǔn)確性（accuracy）參考范圍（reference

range）可報(bào)告范圍（reportable

range）AS:分析敏感性（analytic

sensitivity）AS:分析特異性（analytic

specificity）54準(zhǔn)確性?

使用熒光PCR結(jié)合熔解曲線法檢測的標(biāo)本同時(shí)送第三方測序公司（上海生物工程技術(shù)公司）測序。兩者結(jié)果進(jìn)行比較。55試驗(yàn)方法與測序法的一致性比較（例）熒光PCR結(jié)合測序法（參考方法）合計(jì)熔解曲線法突變型野生型合計(jì)2503282957293225?

使用Kappa值衡量兩方法之間的一致性。?

結(jié)果：Kappa=0.89，說明兩方法之間具有非常好的一致性。56精確性?

批內(nèi)重復(fù)性?

批間重復(fù)性?

不同儀器之間平行實(shí)驗(yàn)?

不同人員?

不同批次合成的引物?

結(jié)果：符合率100％57參考值以及可報(bào)告范圍的建立?

報(bào)告結(jié)果為：“突變型”或“野生型”?

正常參考值為：“野生型”?

報(bào)告結(jié)果的解釋:檢出JAK2

V617F突變型需要結(jié)合血常規(guī)、EPO等一系列檢測幫助診斷一類