核酸生物合成

關(guān)于核酸生物合成PPT第1頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月中心法則：

第2頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)DNA生物合成的方式

一、DNA生物合成的概念

DNA的生物合成是指在生物體內(nèi)通過酶促聚合反應(yīng)合成DNA分子。DNA的生物合成有DNA指導的DNA合成、RNA指導的DNA合成以及修復(fù)合成。第3頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA指導的DNA合成是指以親代DNA為模板,合成新的、與親代模板完全一樣的子代DNA分子的過程，故這種合成也稱為DNA復(fù)制，它是細胞內(nèi)DNA合成的最主要方式。

RNA指導的DNA合成是指以RNA為模板，合成與RNA核苷酸序列相對應(yīng)的DNA分子的過程。因在其過程中，遺傳信息的流動方向與轉(zhuǎn)錄過程的方向相反，故稱RNA指導的DNA合成為逆轉(zhuǎn)錄合成。逆轉(zhuǎn)錄作用廣泛存在于生物界,在RNA病毒感染宿主的致病過程有重要意義。

此外，某些物理、化學或生物學(病毒)因素可導致DNA分子的損傷,生物體細胞內(nèi)存在DNA修復(fù)合成體系,可使損傷的DNA分子得以修復(fù)，也稱修復(fù)合成。第4頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、DNA復(fù)制合成的基本規(guī)律第5頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）DNA的半保留復(fù)制1.定義以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。第6頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)制的可能方式全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制第7頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA半保留復(fù)制圖示：第8頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月2.半保留復(fù)制的實驗證據(jù)

1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。第9頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA的雙向復(fù)制DNA的復(fù)制是雙向復(fù)制。復(fù)制時，DNA從起始點（origin）向兩個方向解旋，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。第10頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月雙向復(fù)制單向復(fù)制第11頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)制中的DNA

復(fù)制原點復(fù)制叉第12頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩條鏈是反平行的，復(fù)制時DNA的兩條鏈均作為模板，分別合成兩條子代DNA鏈，而DNA合成的方向只能是5’→3’。在DNA復(fù)制時，一條子代DNA鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進方向相同，可以連續(xù)復(fù)制，稱為前導鏈（leadingstrand）；而另一條子代DNA鏈的合成方向和復(fù)制叉的前進方向正好相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成幾個片段合成，稱之為后隨鏈（laggingstrand）。后隨鏈首先合成的是不連續(xù)的短DNA片段，叫岡崎片段。前導鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是DNA的半不連續(xù)復(fù)制。第13頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA的復(fù)制叉與半不連續(xù)復(fù)制

第14頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）DNA復(fù)制的高保真性

DNA復(fù)制的精確度極高，誤差率很低，DNA復(fù)制的高度忠實性至少要依賴三種機制：1、遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2、DNA聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能；3、復(fù)制出錯時，DNA聚合酶的即時校讀功能。DNA復(fù)制高保真性的意義在于使親代的遺傳信息準確地傳遞給子代，從而使親代和子代間保持遺傳的穩(wěn)定性。DNA的復(fù)制一旦出現(xiàn)差錯，將會引起遺傳信息的改變，可能引起生物的變異。第15頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)制的主要方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）真核細胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）第16頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA復(fù)制的主要方式3不同位置D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點不同位置，且復(fù)制不同步）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）第17頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)DNA復(fù)制所需的酶類和蛋白質(zhì)DNA復(fù)制的本質(zhì)是脫氧核苷酸之間通過生成3’,5’磷酸二酯鍵，發(fā)生鏈式聚合反應(yīng)的過程。DNA復(fù)制的反應(yīng)體系包括：底物、聚合酶、模板、引物和其它酶及蛋白質(zhì)因子。四種底物是指dNTP，即dATP、dTTP、dGTP和dCTP。聚合酶是指依賴DNA的DNA聚合酶，簡稱DNA-pol。模板指解開成單鏈的DNA母鏈。引物是指提供3‘－OH末端，使dNTP可以通過生成3’,5’磷酸二酯鍵而發(fā)生依次聚合的短鏈RNA分子。在這一過程中，DNA聚合酶起主要催化作用，還有其它多種起不同的作用酶和蛋白質(zhì)因子參與。第18頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、DNA聚合酶：DNA指導下的DNA合成原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補。3’-OH.

需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.

合成方向：53屬于多功能酶，它們在DNA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。

酶的催化性質(zhì)：第19頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶

第20頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)原核生物DNA聚合酶

在原核生物大腸桿菌中DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(簡寫DNApolⅠ，DNApolⅡ和DNApolⅢ)。實驗證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過程靠DNApolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA錯配的校正和修復(fù)中起作用。第21頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月1、1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶,含一個鋅原子。為多功能酶，具有:

（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（對雙鏈無作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈，只作用于生長中不配對的單鏈，校對功能。）；（3）還具有53’外切酶活性（雙鏈有效）；該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對DNA損傷的修復(fù)能力下降，容易導致變異和死亡。推測該酶主要是對DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時RNA引物切除及其缺口的填補。1、DNA聚合酶Ⅰ:第22頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月2、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ:多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。第23頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA聚合酶Ⅲ多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復(fù)合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時大腸桿菌因DNA復(fù)制抑制而致死。因此認為該酶DNA的真正復(fù)制酶。DNA聚合酶Ⅲ第24頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶Ⅲ的β-鉗子俯視圖DNA雙螺旋第25頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結(jié)構(gòu)基因＊不同種類的亞基數(shù)目相對分子質(zhì)量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)PolB≥788,000＋－2,4001,500修復(fù)PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復(fù)制

大腸桿菌三種DNA聚合酶比較第26頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、真核生物DNA聚合酶

真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它們的基本特性相似于大腸桿菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性。第27頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月真核生物的DNA聚合酶

αβγδε亞基數(shù)4＞2504425分子量（KD)36-38160-300170256細胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制復(fù)制第28頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月真核細胞DNA復(fù)制

DNApolα主要負責染色體DNA的復(fù)制。 DNApolβ的模板特異性是具有缺口的DNA分子，被認為它與DNA修復(fù)有關(guān)。 DNApolγ在線粒體DNA的復(fù)制中起作用。 DNApolδ不但有5′→3′聚合活性，而且還具有3′→5′外切酶活性。 真核生物DNA復(fù)制是在DNApolα和DNApolδ協(xié)同作用下進行的， 前導鏈的合成靠DNApolδ催化，并且還需要一種細胞周期調(diào)節(jié)因子增殖細胞核抗原（proliferatingcellnucleusantigen,PCNA)參與。 而后隨鏈的合成時，岡崎片段和引物合成分別由DNApolδ和DNApolα酶完成。第29頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、參與復(fù)制的其他酶和蛋白質(zhì)因子

DNA復(fù)制過程是極其復(fù)雜的過程。除了DNA聚合酶，還有其它酶和蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制。

第30頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）解旋酶

DNA開始復(fù)制時首先在起始點處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解旋酶(helicase)的催化下進行的。解旋酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有解旋酶活性，與后隨鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動，還有一種Rep蛋白和前導鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動。解旋酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。第31頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）單鏈結(jié)合蛋白

單鏈結(jié)合蛋白(singlestrandbindingproteins,SSBP)的作用是與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定，不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證單鏈DNA做為模板時的伸展狀態(tài)。單鏈結(jié)合蛋白可以重復(fù)利用。第32頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）拓撲異構(gòu)酶

拓撲是指物體或圖像作彈性位移而保持物體原有的性質(zhì)。在DNA復(fù)制過程中，需要部分DNA呈現(xiàn)松弛狀態(tài)，這使其它部分的DNA由于呈現(xiàn)正、負超螺旋狀態(tài)而出現(xiàn)打結(jié)或纏繞等拓撲學性質(zhì)的改變。DNA拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和重新連接而直接改變DNA拓撲學性質(zhì)的酶。在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和染色質(zhì)重塑等過程中，DNA拓撲異構(gòu)酶的作用是調(diào)整DNA的超螺旋程度，促進DNA和蛋白質(zhì)相互作用，防止DNA形成不利的過度超螺旋。第33頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA超螺旋與DNA拓撲異構(gòu)酶

第34頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月人類DNA拓撲異構(gòu)酶分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種Ⅰ型拓撲異構(gòu)酶不需要ATP,能切斷DNA雙鏈中的一股，它使DNA解旋中不打結(jié)，并在適當?shù)臅r候連接切口。Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶能切斷DNA的雙鏈，它在無ATP時，能夠切斷及時清除復(fù)制叉前進中的正超螺旋；在有ATP供能時，由于不具有旋轉(zhuǎn)酶活性,不能使松弛狀態(tài)的DNA進入負超螺旋，斷端在同一酶催化下連接恢復(fù)。Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶主要參與DNA復(fù)制。第35頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）引物酶

引物酶(primase)是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短片段RNA一般由十幾個至數(shù)十個核苷酸組成，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置。第37頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）連接酶

連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3’,5’－磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(或NAD＋)。在DNA復(fù)制中,連接酶連接后隨鏈相鄰DNA片段的缺口，形成完整的DNA鏈。此外，在DNA修復(fù)、重組和剪接中，DNA連接酶起連接缺口的作用。第38頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶

第39頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月參與DNA復(fù)制的酶與蛋白因子總覽圖第40頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)DNA生物合成（復(fù)制）過程真核生物的DNA復(fù)制過程與原核生物的基本相似。DNA復(fù)制是以復(fù)制子為單位進行的。復(fù)制過程分成三個階段，

第一個階段為DNA復(fù)制的起始階段，這個階段包括起始點，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成，

第二階段為DNA鏈的延長，包括前導鏈及后隨鏈的形成和切除RNA引物后填補空缺及連接崗崎片段。

第三階段為DNA復(fù)制的終止階段。第41頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的復(fù)制過程：（以大腸桿菌為例）

復(fù)制的終止：

復(fù)制的起始起始復(fù)合物的形成：稱為引發(fā)RNA引物的合成

鏈的延伸：第42頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、起始大腸桿菌的固定復(fù)制起始點稱為OriC，它由245bp的堿基組成，其中含有3組13bp的串聯(lián)重復(fù)序列（富含AT）以及2對9bp反向重復(fù)序列。13bp的重復(fù)序列因為富含AT而容易解鏈。大腸桿菌DNA的復(fù)制起始點OriC結(jié)構(gòu)第43頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)制起始1、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個9bp的重復(fù)序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個bp的重復(fù)序列,形成開鏈復(fù)合物。4、DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’

→3’方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。第44頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、延長大腸桿菌DNA復(fù)制的延長

第45頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月鏈的延長（岡崎片段的合成）

真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp第46頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型第47頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:第48頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月前導鏈和滯后鏈的合成（DNA聚合酶的異二聚體催化）第49頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、復(fù)制的終止Ter，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質(zhì)Tus可識別并結(jié)合，從而導致DNA復(fù)制的終止。第50頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、復(fù)制的終止在大腸桿菌中，染色體DNA復(fù)制終止于終止區(qū)（terminus）。在該區(qū)域的兩側(cè)存在兩組由23bp組成的終止子位點，即Ter位點。Ter位點富含GT，能特異性地結(jié)合Tus蛋白。Tus蛋白被稱為終止區(qū)利用物質(zhì)（terminatiorutilizationsubstance,Tus蛋白），是解旋酶（DnaB蛋白）的抑制劑。當Tus蛋白Ter位點結(jié)合以后，復(fù)制叉的前進被阻止。因此，當一個復(fù)制子中的兩個復(fù)制叉在終止區(qū)相遇后，DNA復(fù)制即停止。第51頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、真核生物DNA復(fù)制的特點1、真核生物染色體有多個復(fù)制起點，稱為自主復(fù)制序列（ARS）或復(fù)制基因(replicator);多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2、岡崎片段長約100-200bp。第52頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月4、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點不再重新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點使總體復(fù)制速度比原核生物更快。3、真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。四、真核生物DNA復(fù)制的特點第53頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、真核DNA復(fù)制特點5、真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串的重短復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶.第54頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月端粒真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端粒(telomeres)，端粒是由重復(fù)的寡核苷酸序列構(gòu)成的。由于所有生物DNA聚合酶都只能催化DNA從5′→3′的方向合成，因此當真核生物DNA復(fù)制終止時，復(fù)制叉到達真核生物線性染色體末端，前導鏈可以連續(xù)合成到頭，而由于后隨鏈是以一種不連續(xù)的形式合成崗崎片段，除去最后的RNA引物后，留下空隙，所以不能完成線性染色體末端的復(fù)制。剩下單鏈DNA母鏈，如果不填補成雙鏈，就會被核內(nèi)核糖核酸酶降解，確有可能引起染色體線性DNA的末端縮短。但是，通過端粒酶的催化合成可以補償這種染色體末端的縮短，從而維持DNA復(fù)制的完整性。第55頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月端粒酶(telomerase)端粒酶(telomerase)是真核生物體內(nèi)存在的一種酶。人類端粒酶由三部分組成： 具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的蛋白質(zhì)部分端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)、 具有模板作用的端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)和 端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)的。第56頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月端粒酶與端粒人類端粒酶的作用是通過端粒酶RNA識別并結(jié)合DNA母鏈，以自身的RNA為模板，在DNA的3′OH末端以逆轉(zhuǎn)錄方式復(fù)制延長單鏈DNA母鏈；當單鏈DNA母鏈復(fù)制延長足夠長度后，延長的DNA母鏈可以發(fā)生反折，而端粒酶脫離母鏈；然后，以這種延長的DNA母鏈為模板，以反折的DNA母鏈為引物，在DNA聚合酶作用下，從3′-OH末端繼續(xù)合成后隨鏈，填補空隙。因此，端粒酶在保證染色體復(fù)制的完整性上有重要意義。第57頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月端粒酶的生物學功能研究表明，端粒酶活性的下降與細胞的老化有關(guān)；某些增殖活躍的腫瘤細胞中，端粒酶活性增高。對端粒和端粒酶的研究，有可能揭示細胞生長、增殖、衰老以及腫瘤發(fā)生的新機制，對尋找腫瘤治療的新靶點有意義。第58頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月7、RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口。6、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力。PCNA稱為增殖細胞核抗原，相當于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當于夾子裝配器。四、真核生物DNA復(fù)制的特點第59頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月真核細胞內(nèi)有五種DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亞基數(shù)目外切酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力抑制劑功能細胞核4－＋中等蚜腸霉素引物合成細胞核1－－低雙脫氧TTP修復(fù)線粒體23’→5’外切酶－高雙脫氧TTP線粒體DNA合成細胞核23’→5’外切酶－有PCNA時高蚜腸霉素核DNA合成細胞核＞15’→3’外切酶－高蚜腸霉素修復(fù)第60頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）是以RNA為模板合成DNA的過程。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，遺傳信息從RNA流向DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程遺傳信息流動的方向相反。第62頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月

用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對一般RNA病毒的復(fù)制無影響。已知放線菌素D專門抑制以DNA為模板的反應(yīng)，可見致癌RNA病毒的復(fù)制過程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說。

1970年，Temin和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。第63頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）由一個α亞基和一個β亞基組成，含有Zn2+，需要RNA或DNA作引物。逆轉(zhuǎn)錄酶具有三種酶活性： 一是RNA指導的DNA聚合酶活性（以RNA為模板，合成一條互補的DNA，形成RNA—DNA雜種分子）； 二是RNaseH酶活性，水解RNA—DNA雜交體分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用； 三是DNA指導的DNA聚合酶活性。 無校對功能，錯誤率高，易產(chǎn)生變異。第64頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、逆轉(zhuǎn)錄過程

第65頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月cDNA在基因操作中，以某一特殊mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成的DNA稱為互補DNA(complementaryDNA，cDNA)。通過cDNA克隆測序，可以推測mRNA的序列及其編碼的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。第66頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、逆轉(zhuǎn)錄的生物學意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)現(xiàn)，是對遺傳信息傳遞中心法則的補充，揭示遺傳信息不僅可以從DNA流向RNA，也可以相反，至少在某些生物，RNA與DNA同樣具有遺傳信息傳遞和表達的功能。同時，加深了對RNA病毒致癌、致病的認識。逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為制備cDNA，進行基因操作的工具酶。第67頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史第68頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)DNA的損傷與修復(fù)DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素經(jīng)常會導致DNA分子的改變。組成DNA分子的脫氧核苷酸或者DNA片段在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化，稱為DNA突變也是DNA損傷(DNAdamage)。有的DNA損傷或突變是致死性的，可以導致個體、細胞的死亡。因此修復(fù)DNA損傷、維護DNA分子的完整性對生物能保持遺傳穩(wěn)定性至關(guān)重要。另一方面，突變又是生物進化的分子基礎(chǔ)，是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象。第69頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、造成DNA損傷的因素

造成DNA損傷的因素有生物體內(nèi)自發(fā)的、亦有外界物理和化學等因素。 (一)自發(fā)的因素 (二)物理因素 (三)化學因素第70頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)自發(fā)的因素 由于DNA分子受到周圍環(huán)境溶劑分子的隨機熱碰撞，腺嘌呤或鳥嘌呤與脫氧核糖間的N-糖苷鍵可以斷裂，使A或G脫落。人體細胞中DNA每天每個細胞要脫落5000個嘌呤堿，每天每個細胞也有100個胞嘧啶自發(fā)脫氨而成尿嘧啶。第71頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)物理因素

紫外線造成DNA損傷。由于嘌呤環(huán)與嘧啶環(huán)都含有共軛雙鍵，能吸收紫外線而引起DNA損傷。嘧啶堿引起的損傷比嘌呤堿大10倍。紫外線損傷是由于2個相鄰嘧啶堿的C5和C6共價交聯(lián)，產(chǎn)生嘧啶二聚體。

第72頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)化學因素烷化劑對DNA的損傷烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生堿基烷基化、堿基脫落、斷鏈、交聯(lián)等各種類型的損傷?；瘜W物質(zhì)修飾DNA鏈上的堿基或通過影響DNA復(fù)制而改變堿基序列，例如亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，黃曲霉素B也能專一攻擊DNA上的堿基導致序列的變化，這些都是誘發(fā)突變的化學物質(zhì)或致癌劑。第73頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、DNA損傷的類型

根據(jù)DNA分子的改變，可把突變分為下面幾種主要類型。錯配缺失、插入重排第74頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、DNA損傷的修復(fù)

DNA修復(fù)(DNArepairing)是細胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這種DNA的損傷而能繼續(xù)生存。DNA修復(fù)包括直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù)等。第75頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）錯配錯配（mismatch）也稱點突變(pointmutation)，是DNA分子上一個堿基的變異，可分為：①轉(zhuǎn)換(transition)同型堿基，如一種嘌呤代替另一種嘌呤或一種嘧啶代替另一嘧啶。②顛換(transversation)異型堿基，即嘌呤變嘧啶，或嘧啶變嘌呤。 點突變?nèi)绨l(fā)生在啟動子或剪接信號部位可以影響整個基因的功能；如發(fā)生在編碼序列，有的可以改變蛋白質(zhì)的功能，如引起鐮形紅細胞貧血；有的則為中性變化，即編碼氨基酸雖然變化，但功能不受影響；有的甚至是靜止突變，堿基雖變但編碼氨基酸種類不變。第76頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月點突變引起鐮形紅細胞貧血

第77頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）缺失、插入缺失(deletion)是一個堿基或一段核苷酸鏈乃至整個基因，從DNA大分子上丟失。插入(insertion)是一個原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸序列插入到DNA大分子中去，或有些芳香族分子如吖啶(acridine)嵌入DNA雙螺旋堿基對中。缺失或插入可以引起框移突變(frame-shift-mutation)，影響三聯(lián)體密碼的閱讀方式，如有些地中海貧血、生長激素基因缺失。第78頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）重排

重排（rearragement）DNA鏈內(nèi)部重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置或者一段DNA從一處遷移到另一處。由于血紅蛋白β鏈和δ鏈兩種類型的基因重排而引起的地中海貧血。第79頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月突變或誘變對生物可能產(chǎn)生的后果 ①致死性； ②喪失某些功能； ③改變基因型(genotype)而不改變表現(xiàn)型(phenotype)； ④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進化。第80頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA突變可能導致腫瘤的發(fā)生:

沉默突變：突變影響非必需的DNA或突變對一個基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變?；貜?fù)突變：一些突變可以克服第一次突變造成的影響，這類突變稱為回復(fù)突變。動物細胞的突變與癌的發(fā)生有強烈的相關(guān)性。第81頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、DNA損傷的修復(fù)

DNA修復(fù)(DNArepairing)是細胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這種DNA的損傷而能繼續(xù)生存。DNA修復(fù)包括直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù)等。第82頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）直接修復(fù)光修復(fù)是直接修復(fù)（directrepair）的一種形式。光修復(fù)主要存在于低等生物。幾乎所有細胞都含有光復(fù)活酶(photoreactivatingenzyme)，也稱為DNA光修復(fù)酶(photolyase)。當紫外線280nm照射時，DNA產(chǎn)生的嘧啶二聚體。但在可見光300-600nm照射下，光復(fù)活酶能夠被激活，從而解聚嘧啶二聚體。第83頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）切除修復(fù)切除修復(fù)(excisionrepair)是指在一系列酶的作用下，切除損傷的DNA部分，以完整的另一條鏈為模板，填補切除部分的空隙并連接，使損傷的DNA部分恢復(fù)正常。切除修復(fù)途徑對所有生物的生存至關(guān)重要。第84頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月切除修復(fù)是真核細胞的重要修復(fù)形式。人類遺傳性疾病著色性干皮病(xerodermapigmentosum)，是常染色體隱性遺傳性疾病。純合子患者的皮膚對陽光或紫外線極度敏感，皮膚變干、真皮萎縮、角化、眼瞼結(jié)疤、角膜潰瘍，易患皮膚癌。此病是由于缺乏紫外特異內(nèi)切核酸酶而無法修復(fù)造成的。第85頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)重組修復(fù)

切除修復(fù)發(fā)生在DNA復(fù)制之前。如果DNA復(fù)制要越過尚未修復(fù)的損傷部位，或者因為損傷的DNA片段較長不能在復(fù)制前完全修復(fù)時，可以先進行復(fù)制，然后再進行重組修復(fù)。重組修復(fù)（recombinationrepair）是指DNA復(fù)制后，子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)空隙時，可以通過分子間的重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的DNA片段轉(zhuǎn)移到子代DNA的空隙處，母鏈留下的空隙處通過以另一條完好的母鏈DNA鏈為模板在DNA聚合酶作用下進行修復(fù)，最后由DNA連接酶連接而封口(圖)。重組修復(fù)過程中，子代DNA損傷的空隙被補上了，但是DNA鏈的損傷并未除去。第86頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月重組修復(fù)至少需要4種酶組分。重組基因recA編碼一種分子量為40kDa的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認為在DNA重組和重組修復(fù)中均起關(guān)鍵作用。recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個亞基。第87頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）SOS修復(fù)

SOS修復(fù)（SOSresponse）是一類應(yīng)急性的修復(fù)方式。由于DNA損傷廣泛至難以繼續(xù)復(fù)制，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。SOS修復(fù)特點是反應(yīng)特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細胞是可存活的。然而，DNA保留的錯誤會較多，引起較廣泛、長期的突變。第88頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月SOS反應(yīng)和誘導修復(fù)（易錯修復(fù)）SOS反應(yīng)：細胞DNA受到嚴重損傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急狀態(tài)下，為求生存而出現(xiàn)的應(yīng)急反應(yīng)。SOS反應(yīng)包括:避免差錯的修復(fù)能力增強誘導產(chǎn)生無校正功能的DNA聚合酶合成抑制細胞分裂第89頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月SOS修復(fù)Irradiationofbacteriabeforevirusinfectionenhancedrepairofdamagedviralgenesbutledtomutations.UVUV’dT4phage

E.coliFewsurvivingphageUV’dT4phage

E.coliHigherfrequencyofsurviving

phage,butmanymutants.第90頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月SOS修復(fù)誘導DNA聚合酶活性LexA

(一種DNA結(jié)合抑制蛋白),

umuC

和umuD,編碼DNA聚合酶活性,允許復(fù)制跨過損傷位點,常插入一個或幾個A堿基.AGCTAGTCAT/TCAGTCAGCTAGTCAT/TCAGTCTCGATCANNNNGTCAGReplicationstopsatT/TdimerError-pronepolymeraseallowsreplicationtoproceed,albeitinaccuratelySOSresponse:第91頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月RecA-P的三種功能a、DNA重組活性b、與S.S.DNA結(jié)合活性c、少數(shù)蛋白的proteinase活性當DNA正常復(fù)制時（無復(fù)制受阻，無DNA損傷，無TTdimer）

RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性第92頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月當DNA復(fù)制受阻/DNAdamaged細胞內(nèi)原少量表達的RecA-p與S.S,DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復(fù)損傷LexA-p降解RecA-p高效表達SOSopen當DNA復(fù)制度過難關(guān)后RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff第93頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月SOS修復(fù)

DNA復(fù)制不很嚴格，新合成的DNA容易造成錯誤產(chǎn)生突變。第94頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體損傷和修復(fù)線粒體的氧化損傷:

單鏈斷裂、雙鏈斷裂、堿基修飾、DNA交聯(lián)、烷化損傷線粒體的損傷修復(fù)：

堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)第95頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA修復(fù)維持DNA序列的保真性；可在復(fù)制前后進行；有多種修復(fù)機制來糾正DNA損傷；DNA修復(fù)失敗可能導致突變和腫瘤。第96頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞周期檢查點控制

真核生物細胞DNA受到損傷時細胞除了誘導修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄外，還可暫時阻斷細胞周期，防止受損DNA繼續(xù)復(fù)制，如無法修復(fù)，則可誘導細胞進入凋亡。這些都是細胞通過細胞周期檢查點控制（checkpointcontrol，又稱關(guān)卡控制）對DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。第97頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母細胞的細胞周期檢查點控制機制DNA損傷在S期DNA損傷在G1

和G2

期G1SG2MPOL2RFC5DPB11RAD9RAD17RAD24MEC3MEC1,TEL1RAD53第98頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月哺乳類動物的細胞周期檢查點控制機制DNA損傷P21Gadd45BaxP53CDK/cyclinGadd45Gadd45-PCNABlockingcellcycleExcisionrepairingCellapoptosis第99頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

DNA損傷和修復(fù)的生物參考標志第100頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月一、甲基化損傷修復(fù)相關(guān)基因

甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）把O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，修復(fù)甲基化的DNA。MGMT突變可作為甲基化損傷的基因型標記物。第101頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月二、切除修復(fù)相關(guān)的酶和基因尿嘧啶糖基化酶為主要的始動因素，可作為DNA損傷的生物標記物。大腸桿菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修復(fù)基因等第102頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月三、錯配修復(fù)相關(guān)基因MSH2、MLH1等蛋白參與錯配修復(fù)，而錯配修復(fù)的缺陷往往是癌變的第一步。錯配修復(fù)基因：Muthls系統(tǒng)、人類的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。錯配修復(fù)基因的微衛(wèi)星序列的不穩(wěn)定性（microsatelliteinstability，MI）第103頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月四、DNA聚合酶β

DNA聚合酶β參與輻射損傷和化學損傷的修復(fù)，并對細胞的生長具有調(diào)節(jié)作用。

DNA聚合酶β

的突變可導致堿基切除修復(fù)功能的缺陷。第104頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月五、DNA加合物也可作為修復(fù)功能的生物標記物

DNA加合物可作為DNA損傷的暴露標記物和效應(yīng)標記物，其去除的速度也可作為DNA修復(fù)功能的生物標記物。第105頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA損傷和修復(fù)的生物學意義避免基因組的不穩(wěn)定性、癌癥和細胞死亡是至關(guān)重要的。DNA修復(fù)途徑可以識別和修復(fù)特異的DNA損傷，保證生物物種的遺傳穩(wěn)定性。第106頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月與DNA修復(fù)有關(guān)的人類遺傳疾?。褐愿善げ?Xerodermapigmentosum)

布倫氏癥候群(Bloom’ssyndrome)

遺傳性大腸癌(Hereditarynonpolyposiscoloncancer；HNPCC)

第107頁，課件共128頁，創(chuàng)作于2023年2月著色性干皮病

(Xerodermapigmentosum)

是一種隱性遺傳性疾病，有些呈性聯(lián)遺傳。因核酸內(nèi)切酶異常造成DNA修復(fù)障礙所致。臨床以光暴露部位色素增加和角化及癌變?yōu)樘卣鳌?/p>

1.幼年發(fā)病，常有家族發(fā)病史。2.面部等暴露部位出現(xiàn)紅斑、褐色斑點及斑片，伴毛細血管擴張，間有色素脫失斑和萎縮或疤痕。皮膚干燥。數(shù)年內(nèi)發(fā)生基底細胞癌、鱗癌及惡性黑素瘤。3.皮膚和眼對日光敏感。4.病情隨年齡逐漸加重，多數(shù)患