病毒-病毒感染的檢測(cè)方法（動(dòng)物微生物）

病毒感染的檢查方法電鏡技術(shù)血清學(xué)試驗(yàn)分子生物學(xué)技術(shù)病毒的分離鑒定標(biāo)本采集與送檢一、標(biāo)本采集與送檢原則：1.盡早采?。喊l(fā)病初期

2.部位適宜：由感染部位采取

3.冷藏速送：裝有冰塊或干冰的容器內(nèi)（一）供分離病毒、檢出核酸及抗原的標(biāo)本（二）檢測(cè)特異性抗體的標(biāo)本

采集雙份血清，4-20℃保存病毒材料采集與檢驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系采取標(biāo)本的時(shí)期檢查病毒及其成分測(cè)定抗體潛伏期及前驅(qū)期剛發(fā)病或急性期恢復(fù)期及康復(fù)期較難查見最多查見很難查見未增多未增多或增多不明顯明顯增多（常超過4倍）病毒分離是診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，一旦陽性，即可確診。不適用于快速診斷，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本高，陽性檢出率低等。有時(shí)不得不分離病毒，例如發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒病，必須分離病毒進(jìn)行研究，或者分離株的鑒定對(duì)流行病學(xué)有很大作用（如流感病毒），或者需要培育疫苗，或者希望獲得天然弱毒株等。二、常規(guī)分離與鑒定（一）病毒分離標(biāo)本采集殺滅雜菌（青鏈霉素）接種鑒定病毒種型易感動(dòng)物出現(xiàn)病狀雞胚病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變?nèi)蠓椒ǎǘ┎《捐b定1.形態(tài)學(xué)鑒定觀察CPE。常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體。正常細(xì)胞病變細(xì)胞感染細(xì)胞具有吸附紅細(xì)胞的能力感染細(xì)胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在，具有凝集紅細(xì)胞的作用2.血吸附和血凝作用多見于以出芽方式釋放的病毒。紅細(xì)胞吸附正常細(xì)胞（1）血吸附作用吸附試驗(yàn)可通過特異抗血清抑制來達(dá)到鑒定具有吸附特性的病毒（2）血凝作用血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)（3）病毒成分的直接檢測(cè)用免疫學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)直接檢查感染細(xì)胞或其上清液中病毒抗原（或核酸）。三、電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進(jìn)行檢查。對(duì)于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。透射電子顯微鏡1.正染法：超薄切片法取材固定戊二醛四氧化鋨清洗與脫水浸透包埋聚合切片染色鈾染鉛染雞痘病毒（超薄切片）超薄切片法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，但標(biāo)本可長(zhǎng)時(shí)間保存2.負(fù)染技術(shù)負(fù)染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。銅網(wǎng)樣品

濾紙染液（常用磷鎢酸）1-2分鐘后電鏡觀察口蹄疫病毒的電鏡負(fù)染負(fù)染法的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)易（10-20min）；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在107以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮狀態(tài)免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。

3.免疫電鏡技術(shù)(Immuneelectronmicroscopy，IEM)（1）免疫凝集電鏡技術(shù)抗原與抗體凝集反應(yīng)后，可使標(biāo)本中病毒顆粒聚集成團(tuán)，再經(jīng)負(fù)染直接在電鏡下觀察，提高了敏感性，確定病毒的血清學(xué)性質(zhì)。（2）免疫電鏡定位技術(shù)特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、過氧化物酶等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。

酶標(biāo)記染色

四、血清學(xué)試驗(yàn)是一種常用的診斷病毒病的方法?？刹捎肊LISA、瓊脂擴(kuò)散、中和試驗(yàn)、標(biāo)記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長(zhǎng)情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。virus1.中和反應(yīng)觀察特異性抗體能否保護(hù)易感的試驗(yàn)動(dòng)物死亡，能否抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。凡能與病毒結(jié)合，使其失去感染力的抗體又稱中和抗體。2.補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)AgAb紅細(xì)胞溶血素補(bǔ)體AbAg紅細(xì)胞補(bǔ)體溶血素溶血（-）不溶血（+）3.免疫擴(kuò)散

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)，將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。（1）間接ELISA（2）夾心ELISA3′3′5′5′3′3′3′3′3′3′5′5′5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′模板DNA雙鏈形成新的雙鏈DNA退火變性五、分子生物學(xué)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）2.核酸雜交技術(shù)核酸探針（probe）是指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段，可檢測(cè)待檢樣品中特定的基因順序。六、感染組織的組織學(xué)檢查病毒在光學(xué)顯微鏡下無法看到，但是在某些病毒感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體，或者細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，則對(duì)診斷有重要意義。如Negri氏包涵體是狂犬病犬腦細(xì)胞的特征。病理組織或滲出液作成涂片檢查包涵體時(shí)，常用蘇木紫-伊紅染色法。狂犬病毒包涵體（Negribody）一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.血凝試驗(yàn)(HA)檢測(cè)新城疫抗原2.血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)新城疫抗體---用已知抗原來檢測(cè)被檢血清中有無相應(yīng)的特異性抗體及抗體水平。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誋A和HI試驗(yàn)基本原理。掌握1%紅細(xì)胞配制方法；掌握HA試驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定方法；掌握四單位病毒配制的計(jì)算方法；掌握HI試驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定方法。

血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)器材：

移液器（50ul）、槍頭和槍頭盒、槍架

禽類采血器、碘伏棉球、酒精棉球

離心機(jī)、離心管

小燒杯、大燒杯

96孔v型反應(yīng)板、振蕩器

實(shí)驗(yàn)試劑：

新城疫病毒抗原、陽性血清、陰性血清與待檢血清、生理鹽水、抗凝劑96孔v型反應(yīng)板振蕩器新城疫病毒抗原

新城疫陽性血清

四、實(shí)驗(yàn)原理（一）HA原理：某些病毒的血凝素纖突,能選擇性地使某種動(dòng)物地紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（hemagglutination，HA）,也稱直接血凝反應(yīng)（紅細(xì)胞不流淌）,利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血凝試驗(yàn)。病毒顆粒紅細(xì)胞（二）血凝抑制試驗(yàn)（HI）原理：當(dāng)病毒懸液（抗原）中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒的血凝素時(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|。這時(shí)紅細(xì)胞的凝集就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。Iamlate！抗體抗原紅細(xì)胞抗原抗體結(jié)合

五、1%雞紅細(xì)胞液的制備采血：用注射器吸取枸櫞酸鈉抗凝劑0.5mL，采血約2～4mL，輕輕混合均勻，拔下針頭，將血液注入15ml離心管中，加3-4倍體積生理鹽水。洗滌雞紅細(xì)胞3~5次：將離心管中的血液經(jīng)2000r/min離心5~10min，棄上清液。沉淀物加入生理鹽水，輕輕混合，再經(jīng)2000r/min離心5~10min，用移液器移去上清液及沉淀物上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過程后，制得紅細(xì)胞泥。1%雞紅細(xì)胞懸液配制：吸取壓積紅細(xì)胞泥與生理鹽水以1:99進(jìn)行配制1%雞紅細(xì)胞懸液。取50ml燒杯，加入19.8ml生理鹽水，吸取200ul紅細(xì)胞泥注入燒杯中，用1ml移液器反復(fù)吹吸使生理鹽水與紅細(xì)胞混合均勻，備用。注意：制備好的紅細(xì)胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。紅細(xì)胞上層為上清液，下層為沉淀物血凝試驗(yàn)（HA)操作步驟：1、在96孔V型反應(yīng)板上第一排的1－12孔內(nèi)各加入25ul生理鹽水，換槍頭。2、吸取25μL病毒懸液加入第l孔，槍頭浸于液體中緩慢吹吸3-5次，使之充分混勻；從第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，充分混勻后吸取25μL加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μL棄之，換槍頭。3、在1－12孔每孔再加入25ul生理鹽水，換槍頭。4、在1－12孔中，每孔加入25ul的1％雞紅細(xì)胞懸液（注意：將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。5、將96孔V型反應(yīng)板置于振蕩器上振蕩1min或輕叩反應(yīng)板混合反應(yīng)物，放于室溫（20～25℃）或37℃中靜置30～40min。當(dāng)?shù)?2孔紅細(xì)胞對(duì)照孔（C孔）紅細(xì)胞呈明顯的鈕扣狀沉到孔底時(shí)判定結(jié)果。6、HA結(jié)果判定：能使紅細(xì)胞100%凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)為該病毒的血凝效價(jià)。六、血凝試驗(yàn)（HA)

②③④①生理鹽水/ul生理鹽水/ul血凝試驗(yàn)操作步驟HA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：血凝程度用++++、+++、+++、++、+、-表示。++++：紅細(xì)胞完全凝集，即紅細(xì)胞100%凝集，凝集的紅細(xì)胞在孔壁上鋪成薄膜狀，無紅細(xì)胞沉積在孔底。如第一排第1-7孔紅細(xì)胞都是100%凝集。

+++：大部分紅細(xì)胞凝集，凝集的紅細(xì)胞在孔壁上鋪成薄膜，面積較大；但尚有少部分紅細(xì)胞（約25%）未凝集，未凝集的紅細(xì)胞沉積在孔底中心形成小紅點(diǎn)。如第一排第8孔。

++：約有半數(shù)紅細(xì)胞凝集，凝集的紅細(xì)胞在孔壁上鋪成薄膜，面積較小；未凝集的紅細(xì)胞（約50%）沉積在孔底中心聚成小圓點(diǎn)。如第一排第9孔。+：只有少數(shù)紅細(xì)胞凝集；未凝集的紅細(xì)胞（約75%）沉積在孔底中心聚集形成小圓盤狀，凝集的紅細(xì)胞在此小圓盤周圍。如第一排第10孔。-：紅細(xì)胞不凝集，沉積于孔底，形成一圓盤狀或鈕扣狀，邊緣整齊。如第12孔、11孔。HA結(jié)果判定根據(jù)HA的試驗(yàn)結(jié)果配制4血凝單位病毒抗原（4HAU）。即以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例：HA試驗(yàn)中完全血凝的病毒最高稀釋孔是第7孔，則完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù):1：27（1：128），則4個(gè)單位抗原的稀釋倍數(shù)為:1：32（128除以4）。若需配制總體積為32ml的4單位病毒，加入1ml病毒抗原和31ml的生理鹽即可（即：將病毒抗原稀釋了32倍）。

六、4單位病毒的制備血凝抑制試驗(yàn)操作步驟：1、取96孔V型反應(yīng)板，在1～12孔內(nèi)各加入25ul生理鹽水，換槍頭。2、吸取25μL血清加入第1孔內(nèi)，槍頭浸于液體中緩慢吹吸3-5次，使之充分混勻后吸取25μL移加至第2孔，如此依次對(duì)倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL棄去。3、在第1～11孔均加入4HAU病毒液25μL，第12孔加25ul生理鹽水。第11孔為陽性對(duì)照孔，第12孔為陰性對(duì)照孔。4、輕輕震蕩混勻，室溫（20～25℃）靜置30min。5、在第1～12孔每孔均再加入1％雞紅細(xì)胞懸液25ul；6、輕輕振蕩均勻，置于室溫或37℃中靜置30～40min，陰性對(duì)照孔紅細(xì)胞呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。7、結(jié)果判定。以完全抑制4HAU病毒抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI效價(jià)。

七、血凝抑制試驗(yàn)（HI）移液器常用于實(shí)驗(yàn)室少量或微量液體的移取，規(guī)格不同。不同規(guī)格的移液槍配套使用不同大小的槍頭，不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的形狀也略有不同，但工作原理及操作方法基本一致。移液器屬精密儀器，使用及存放時(shí)均要小心謹(jǐn)慎，防止損壞，避免影響其量程。移液器的原理及使用一、實(shí)訓(xùn)目的：了解移液器的原理；掌握移液槍的正確使用方法。熟悉移液器的維護(hù)保養(yǎng)。二、實(shí)訓(xùn)內(nèi)容：移液器的結(jié)構(gòu)移液器的分類移液器的使用方法移液器的維護(hù)和保養(yǎng)移液器的原理及使用容量調(diào)節(jié)旋紐手指把手

槍頭脫卸按鈕容量顯示窗吸頭排出器套筒吸頭圓錐體（一）移液器的結(jié)構(gòu)

（二）移液器的分類

移液器按工作原理可分為：氣體活塞式移液器（常用）外置活塞式移液器氣體活塞式移液器1原理：活塞通過彈簧的伸縮運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)吸液和放液。2加樣體積范圍：1μL~10mL3.實(shí)驗(yàn)室常用移液器規(guī)格：5-50μL量程；20-200μL量程；200-1000μL量程；1-

10mL量程（備注：每種均附上圖片）

3缺點(diǎn):不適宜移取高粘稠度液體、揮發(fā)性較大的液體。易發(fā)生交叉污染。錯(cuò)誤的使用習(xí)慣易造成移液器精度不準(zhǔn)甚至移液器內(nèi)部腐蝕等。吸嘴（一次性）套筒活塞死體積液樣氣體活塞式移液器外置活塞式移液器這種移液器是采用外置式活塞，活塞設(shè)計(jì)在吸頭內(nèi)部，直接與液體接觸，活塞與液體之間沒有空氣段。適用于粘度比較大或者產(chǎn)生氣泡的液體的操作。無空氣間隔，避免了樣品于空氣接觸可能發(fā)生的氣霧交叉污染，因此也非常適合是珍貴的試劑、生物樣品的移取。外置活塞式移液器（三）移液器的使用方法一個(gè)完整的移液循環(huán)：容量設(shè)定--量程的調(diào)節(jié)槍頭安裝預(yù)洗槍頭吸液放液卸去槍頭1.容量設(shè)定--量程的調(diào)節(jié)在設(shè)置量程時(shí)，所設(shè)量程須在移液器量程范圍內(nèi)，不要將按鈕旋出量程，否則會(huì)卡住機(jī)械裝置，損壞了移液器。調(diào)節(jié)所需容量時(shí)一般由大體積處向小體積處旋轉(zhuǎn)，以保證移取的最佳精確度。從大體積調(diào)節(jié)至小體積時(shí)，為正常調(diào)節(jié)法，調(diào)節(jié)到剛好就行；例如：從50ul調(diào)至25ul--直接從50ul調(diào)至25ul即可。從小體積調(diào)節(jié)至大體積時(shí)，就需要先調(diào)節(jié)超過設(shè)定體積的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，可保證最佳的精確度。（這是由于計(jì)數(shù)器里面有一定的空隙，需要彌補(bǔ)）。例如：從25ul調(diào)至45ul---先從25ul調(diào)至46ul，再從46ul調(diào)至45ul。2、槍頭安裝槍頭正確的安裝方法為旋轉(zhuǎn)安裝法：將移液槍(器)垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)即可使其緊密結(jié)合。注意：在將槍頭套上移液槍時(shí)，有的使用者會(huì)使勁地在槍頭盒子上敲幾下，這是錯(cuò)誤的做法，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件(如彈簧)因敲擊產(chǎn)生的瞬時(shí)撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住，嚴(yán)重情況下會(huì)將白套筒折斷。注意：槍頭與移液器應(yīng)匹配，選擇與移液器匹配的，有質(zhì)量保證的槍頭。槍頭與移液器不匹配，會(huì)影響氣密性。3、預(yù)洗槍頭在安裝了新的槍頭或增加了容量值以后，應(yīng)把需要轉(zhuǎn)移的液體吸取、排放兩到三次。液體可以通過槍頭預(yù)潤(rùn)濕的方式來達(dá)到精確移液，先吸入樣液，打出，槍頭內(nèi)壁會(huì)吸附一層同質(zhì)液膜，使表面吸附達(dá)到飽和，然后再吸入樣液，最后打出液體的體積會(huì)很精確。4、吸液正確的吸液方法：垂直吸液：吸取液體前，先用大拇指將按鈕按下至第一停點(diǎn)，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下，然后慢慢松開按鈕回原點(diǎn)，取出移液器。在吸液之前，可以先吸放幾次液體以潤(rùn)濕吸液嘴。注意：吸液速度需緩慢。吸液速度太快會(huì)產(chǎn)生反沖和氣泡，導(dǎo)致移液體積不準(zhǔn)確。吸液時(shí)槍頭浸入液面深度：移液器規(guī)格不同，吸頭浸入液面深度要求不同。

移液器規(guī)格吸頭浸入液面深度50μL和100μL2-3mm200μL和1000μL3-6mm

10mL6-10mm