巴黎重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

巴黎重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）原創(chuàng)性聲明和使用授權(quán)說(shuō)明原創(chuàng)性聲明本人鄭重承諾：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文），是我個(gè)人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或組織已經(jīng)發(fā)表或公布過(guò)的研究成果，也不包含我為獲得及其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或?qū)W歷而使用過(guò)的材料。對(duì)本研究提供過(guò)幫助和做出過(guò)貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。作者簽名：日期：指導(dǎo)教師簽名：日期：使用授權(quán)說(shuō)明本人完全了解大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉?jī)?nèi)容。作者簽名：日期：

學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名： 日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理。作者簽名： 日期：年月日導(dǎo)師簽名：日期：年月日

注意事項(xiàng)1.設(shè)計(jì)（論文）的內(nèi)容包括：1）封面（按教務(wù)處制定的標(biāo)準(zhǔn)封面格式制作）2）原創(chuàng)性聲明3）中文摘要（300字左右）、關(guān)鍵詞4）外文摘要、關(guān)鍵詞5）目次頁(yè)（附件不統(tǒng)一編入）6）論文主體部分：引言（或緒論）、正文、結(jié)論7）參考文獻(xiàn)8）致謝9）附錄（對(duì)論文支持必要時(shí)）2.論文字?jǐn)?shù)要求：理工類設(shè)計(jì)（論文）正文字?jǐn)?shù)不少于1萬(wàn)字（不包括圖紙、程序清單等），文科類論文正文字?jǐn)?shù)不少于1.2萬(wàn)字。3.附件包括：任務(wù)書(shū)、開(kāi)題報(bào)告、外文譯文、譯文原文（復(fù)印件）。4.文字、圖表要求：1）文字通順，語(yǔ)言流暢，書(shū)寫(xiě)字跡工整，打印字體及大小符合要求，無(wú)錯(cuò)別字，不準(zhǔn)請(qǐng)他人代寫(xiě)2）工程設(shè)計(jì)類題目的圖紙，要求部分用尺規(guī)繪制，部分用計(jì)算機(jī)繪制，所有圖紙應(yīng)符合國(guó)家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。圖表整潔，布局合理，文字注釋必須使用工程字書(shū)寫(xiě)，不準(zhǔn)用徒手畫(huà)3）畢業(yè)論文須用A4單面打印，論文50頁(yè)以上的雙面打印4）圖表應(yīng)繪制于無(wú)格子的頁(yè)面上5）軟件工程類課題應(yīng)有程序清單，并提供電子文檔5.裝訂順序1）設(shè)計(jì)（論文）2）附件：按照任務(wù)書(shū)、開(kāi)題報(bào)告、外文譯文、譯文原文（復(fù)印件）次序裝訂

指導(dǎo)教師評(píng)閱書(shū)指導(dǎo)教師評(píng)價(jià)：一、撰寫(xiě)（設(shè)計(jì)）過(guò)程1、學(xué)生在論文（設(shè)計(jì)）過(guò)程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、學(xué)生掌握專業(yè)知識(shí)、技能的扎實(shí)程度□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)和專業(yè)技能分析和解決問(wèn)題的能力□優(yōu)□良□中□及格□不及格4、研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計(jì)方案的合理性□優(yōu)□良□中□及格□不及格5、完成畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）期間的出勤情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫(xiě)規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格建議成績(jī)：□優(yōu)□良□中□及格□不及格（在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫(huà)“√”）指導(dǎo)教師：（簽名）單位：（蓋章）年月日

評(píng)閱教師評(píng)閱書(shū)評(píng)閱教師評(píng)價(jià)：一、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫(xiě)規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格建議成績(jī)：□優(yōu)□良□中□及格□不及格（在所選等級(jí)前的□內(nèi)畫(huà)“√”）評(píng)閱教師：（簽名）單位：（蓋章）年月日教研室（或答辯小組）及教學(xué)系意見(jiàn)教研室（或答辯小組）評(píng)價(jià)：一、答辯過(guò)程1、畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）的基本要點(diǎn)和見(jiàn)解的敘述情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、對(duì)答辯問(wèn)題的反應(yīng)、理解、表達(dá)情況□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、學(xué)生答辯過(guò)程中的精神狀態(tài)□優(yōu)□良□中□及格□不及格二、論文（設(shè)計(jì)）質(zhì)量1、論文（設(shè)計(jì)）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫(xiě)規(guī)范？□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、是否完成指定的論文（設(shè)計(jì)）任務(wù)（包括裝訂及附件）？□優(yōu)□良□中□及格□不及格三、論文（設(shè)計(jì)）水平1、論文（設(shè)計(jì)）的理論意義或?qū)鉀Q實(shí)際問(wèn)題的指導(dǎo)意義□優(yōu)□良□中□及格□不及格2、論文的觀念是否有新意？設(shè)計(jì)是否有創(chuàng)意？□優(yōu)□良□中□及格□不及格3、論文（設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)）所體現(xiàn)的整體水平□優(yōu)□良□中□及格□不及格評(píng)定成績(jī)：□優(yōu)□良□中□及格□不及格教研室主任（或答辯小組組長(zhǎng)）：（簽名）年月日教學(xué)系意見(jiàn)：系主任：（簽名）年月日[摘要]在單因素分析的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化巴黎重樓葉多糖的提取條件。設(shè)置三個(gè)獨(dú)立的變量，包括提取溫度（℃），水料比和時(shí)間（h)并研究其對(duì)多糖得率的影響。采用多元回歸分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)擬合一個(gè)二次多項(xiàng)式方程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行。最佳工藝條件為：提取溫度為90.8℃，水料比為21.3:1，提取時(shí)間為4.8h。在最佳條件下，實(shí)驗(yàn)的回收率為54.18%，與模型預(yù)測(cè)值匹配。此外，純化的多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基離子和超氧陰離子自由基有很強(qiáng)的抗氧化作用。[關(guān)鍵字]重樓優(yōu)化多糖抗氧化

1.引言巴黎滇重樓，廣泛分布在中國(guó)的西南地區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間被作為中藥使用。它能有效的消腫、有效的減輕疼痛、消除咽喉腫痛、治療蛇毒咬傷和擦傷[1]。巴黎滇重樓中有許多生物活性成分，如皂甙，蛻皮激素，植物甾醇和黃酮甙[2]。它們被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、止血和鎮(zhèn)痛[3]。多糖是高分子碳水化合物結(jié)構(gòu)，形成重復(fù)單元由糖苷鍵連接在一起[4]。因?yàn)槎嗵翘厥獾睦砘再|(zhì)和生物活性高，所以對(duì)多糖的研究受到了許多關(guān)注[5]。然而，一些研究已經(jīng)從云南滇重樓葉多糖（PPLPs)提取中開(kāi)展了。熱水提取技術(shù)是常用的植物多糖的提取方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多研究[6]。在提取過(guò)程中，提取率是由多個(gè)獨(dú)立變量影響的。因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)可以確定所有因素的優(yōu)化方法是必要的。另外，要確定最佳提取條件就應(yīng)該考慮自變量之間的相互作用。當(dāng)自變量有一個(gè)聯(lián)合的效果的時(shí)候，響應(yīng)面法（RSM）在優(yōu)化工藝方面是一種有效的統(tǒng)計(jì)技術(shù)。RSM的優(yōu)化過(guò)程比傳統(tǒng)方法需要較少的材料和時(shí)間[7]是一種典型的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。在本設(shè)計(jì)中，處理結(jié)合在試驗(yàn)點(diǎn)，軸點(diǎn)，中心點(diǎn)。設(shè)計(jì)是旋轉(zhuǎn)（或接近旋轉(zhuǎn)），要求每一個(gè)因子五水平。與傳統(tǒng)方法相比CCD能更有效的進(jìn)行試驗(yàn)?；钚匝跏羌?xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。過(guò)多的自由基會(huì)引起許多疾病，如癌癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化。抗氧化劑和癌癥治療的常規(guī)藥物，如BHA、BHT和TBHQ的療效有限并且有顯著的毒性[8]。多糖是一種天然的生物大分子，廣泛存在于生物界中。因?yàn)槎嗵蔷哂锌寡趸?、抗癌和免疫活?dòng)，所以植物多糖引起了極大的關(guān)注。[9]。然而，很少資料是研究PPLPs的。本研究的目的是調(diào)查關(guān)鍵變量（提取溫度，提取時(shí)間和水料比）并進(jìn)一步優(yōu)化pplps的提取工藝。另外，對(duì)獲得純化的多糖及其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

2.材料與方法2.1材料和試劑將巴黎重樓葉干燥，將干燥的材料用粉碎機(jī)，然后過(guò)60目篩。將巴黎重樓葉粉末分別用石油醚（60-90℃）和乙醇在索氏抽提器中回流5小時(shí)。脫脂后將粉末干燥，室溫下放置在干燥器中保存。乙醇，苯酚，硫酸，和葡萄糖分別來(lái)自成都科隆化工廠購(gòu)買。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），1,10-菲咯啉，,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氮藍(lán)四唑（NBT）購(gòu)自西格瑪化學(xué)公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。2.2提取pplps每個(gè)預(yù)處理粉末（1.0克），在設(shè)定的提取溫度，水料比和提取時(shí)間下萃取多糖。將所得的懸浮液通過(guò)離心（5000r/min,10分鐘）分離。收集上清液并加蒸餾水補(bǔ)至100ml。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量[10]。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，并將結(jié)果表示為葡萄糖當(dāng)量。2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定提取變量的初步范圍。設(shè)計(jì)一個(gè)五水平三因素的CCD用于優(yōu)化pplps的提取率的最佳變量組合。分別選擇提取溫度（X1），水與原料的比例（X2），和提取時(shí)間（X3）用于多糖的提取率待優(yōu)化的獨(dú)立變量。三個(gè)變量和五個(gè)水平的范圍如表一所示。提取率（Y）被作為對(duì)三個(gè)變量在表2中的相互作用的響應(yīng)。根據(jù)等式三個(gè)變量進(jìn)行編碼：xi-x0Xi=i=1,2,3(1)△X其中X是獨(dú)立變量的編碼值，Xi獨(dú)立變量的實(shí)際值，X0是自變量的中心點(diǎn)的實(shí)際值，和γx為變量的階躍變化。該系統(tǒng)的行為由下列二次方程解釋：3323Y=A0+∑AiXi+∑AiiXi+∑∑AijXij(2)i=1i=1i=1i=1其中Y是預(yù)測(cè)響應(yīng)，A0是一個(gè)常數(shù)，AI，AII和AIJ是由模型估計(jì)系數(shù)，以及XI和XJ是獨(dú)立變量。這些數(shù)值分別代表的是截距，線性，二次互動(dòng)變量的影響在響應(yīng)面中的情況。該模型評(píng)價(jià)三個(gè)變量的影響。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。來(lái)估計(jì)自變量的響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，并使用設(shè)計(jì)專家軟件預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了計(jì)算[11]。隨后，三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)策略的有效性。2.4制備和多糖的純化取預(yù)處理的樣品（100.0g），采用優(yōu)化的條件下熱水提取方法提取PPLPs溶液。將懸浮液以5000rpm離心10分鐘，并且將上清液收集并濃縮至約100毫升。濃縮液采用Sevag法除蛋白[12]。四體積的乙醇加入到濃縮物中，并將混合物在4℃保持12小時(shí)。收集沉淀物并真空干燥獲得PPLPsPPLPs（1.0克）溶解在去離子水中。該溶液通過(guò)DEAE-纖維素DE-52柱（3厘米×60厘米）膜過(guò)濾（0.45微米;直徑）。用水平衡后，將柱用梯度的NaCl水溶液（0-1.00摩爾/毫升）水洗。將洗脫物收集到10毫升每管并用苯酚-硫酸法確定每管多糖的總含量。主適當(dāng)部分（純化的多糖）收集，透析，并凍干，并指定為PPLP。在使用之前，PPLP溶解在去離子水，并根據(jù)需要稀釋成各種濃度。2.5抗氧化活性的檢測(cè)方法2.5.1對(duì)DPPH自由基清除作用的影響根據(jù)[13]的方法并略有改動(dòng)做多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用實(shí)驗(yàn)。在一個(gè)典型的方法中，將2毫升樣品溶液（0.05，0.1，0.3，0.5，0.7，以及0.9毫克/毫升）和2ml的DPPH的乙醇溶液（0.1毫摩爾/升）混合，混合物在25℃下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)液在517nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除效果，計(jì)算用下面的公式：清除效果（%）=（1-AS/AC）×100其中，AS是樣品和DPPH溶液的混合物的吸光度，和AC是控制反應(yīng)的其中樣品被替換乙醇的吸光度。2.5.2對(duì)羥基自由基清除作用的檢測(cè)羥基自由基測(cè)定按照文獻(xiàn)的方法[14]稍作修改。在一個(gè)典型的方法中加入1.0ml樣品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升）再加入鄰二氮菲（5mM的1.0毫升），磷酸鹽緩沖液（50mM，PH值7.4），硫酸亞鐵（7.5毫，0.5毫升），和H2O2（0.1％，0.5毫升）在37℃下保溫1小時(shí)。在510nm波長(zhǎng)下用光譜儀測(cè)定混合物的吸光度。羥基自由基的清除效果，計(jì)算用下面的公式：清除效果（%）=（1-AS/AC)×100其中，AS是樣品和反應(yīng)溶液的混合物的吸光度，和AC是控制反應(yīng)的其中樣品代替去離子水的吸光度。2.5.3對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的測(cè)定方法對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用的測(cè)定方法按文獻(xiàn)方法[15]略有修改。在一個(gè)典型的方法中，PPLP溶解在水中，稀釋成一系列不同濃度的樣品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升），每個(gè)樣品溶液加入1毫升16毫摩爾/毫升的Tris-HCl（PH8.0，含有557uM+NADH），1毫升16毫摩爾/毫升的Tris-HCl（PH8.0含有108uM+NBT），和1毫升16毫摩爾/毫升Tris-HCl中（PH混合8.0，含45uM的PMS)。將反應(yīng)混合物在25℃下保溫5分鐘，并在560nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算用下面的公式：清除效果（%）=（1-AS/AC)×100%其中，AS是樣品的平均吸光度值，AC為對(duì)照的平均吸光度值。

結(jié)果與討論3.1單因素實(shí)驗(yàn)分析3.1.1提取溫度對(duì)PPLPs提取率的影響當(dāng)提取時(shí)間為3小時(shí)，水與原料的比率為30：1時(shí)研究了溫度對(duì)提取效率的影響，提取過(guò)程中進(jìn)行了在60，70，80，90，和100℃。當(dāng)溫度60℃提高到90℃提取率升高。如圖1（a）所示，提取溫度持續(xù)上升90℃是，提取率提高到了最大量49.15％，然后提取率不在增大。因此，85-95?C的溫度范圍內(nèi)被選為最優(yōu)的CCD的實(shí)驗(yàn)。3.1.2提取時(shí)間對(duì)PPLPs產(chǎn)量的影響提取時(shí)間是影響萃取效率的另一因素。提取過(guò)程中當(dāng)水與原料的比率為30：1，溫度在80℃是時(shí)，提取時(shí)間（2，3，4，5，和6小時(shí)）對(duì)產(chǎn)率的影響，設(shè)計(jì)表如圖1（b）。當(dāng)提取時(shí)間變化從2小時(shí)至6小時(shí)，提取效率提高和PPLPs產(chǎn)量在4小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值的46.44％，然后隨時(shí)間降低。結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)中4-6小時(shí)時(shí)的范圍被認(rèn)為是最佳的提取時(shí)間范圍。3.1.3水與原料的比例對(duì)pplps提取率的影響水與原料的比例是本實(shí)驗(yàn)的重要提取參數(shù)，它可以顯著的影響萃取效率。在本研究中，在提取溫度為80℃，提取時(shí)間為3小時(shí)的條件下，水料比設(shè)定為10:1，20：1，30:1，40:1和50:1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1(c)所示，當(dāng)提取效率提高到47.22%時(shí)，水料比達(dá)到30:1，當(dāng)水料比提高時(shí)，提取效率下降。因此，水料比的最佳范圍在20:1-40:1時(shí)，有利于pplps的提取。3.2pplps的提取條件3.2.1預(yù)測(cè)模型和統(tǒng)計(jì)分析RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣和相應(yīng)的結(jié)果如表2，RMS實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)獨(dú)立變量，包括萃取溫度（X1），水與原料的比率（X2）和提取時(shí)間（X3）?；贑CD的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多元回歸分析，預(yù)測(cè)的模型表示由下述的二次多項(xiàng)式方程：Y=53.41+2.06X1?1.19X2+0.35X3+1.21X1X2?0.55X1X3?0.88X2X3?1.72X12?0.97X22?0.64X32(3)其中Y是多糖的預(yù)測(cè)的良品率，X1，X2和X3分別代表提取溫度，水料比和提取時(shí)間。進(jìn)行方差分析（ANOVA）來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)模型和變量。p值被用作一種工具來(lái)檢查每個(gè)系數(shù)的意義，并表示變量之間的相互作用的模式。p的值是越小，越顯著相應(yīng)系數(shù)。甲顯著缺乏合適的顯示，擬合模型失敗未能代表在該點(diǎn)不包括在回歸中的實(shí)驗(yàn)域的數(shù)據(jù)。方差分析對(duì)提取效率的擬合二次多項(xiàng)式模型示于表3中?！澳Ｐ虵-價(jià)值”54.75隱含的模式是顯著。一個(gè)“F型價(jià)值”有只有0.01％（P<0.0001）的機(jī)會(huì)出現(xiàn)偏差。同時(shí)，“缺乏合適的F值”2.77暗示缺乏合適的不顯著，相對(duì)于純的錯(cuò)誤?！叭狈线m的F值”這個(gè)大的有14.37%，P=0.1437）的發(fā)生機(jī)會(huì)發(fā)生偏差。決定系數(shù)（R2）表明，98.03%的變化可以通過(guò)擬合模型解釋。調(diào)整后的決定系數(shù)的值為0.9626，這也證實(shí)了該模型是高度顯著的。此外，變異系數(shù)相對(duì)較低的值（1.09%）顯示高精度和大量的可靠性實(shí)驗(yàn)值?！白銐虻木葴y(cè)量的信噪比。大于4的比例是可取的。21.10的比例表明適當(dāng)?shù)男盘?hào)。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該模型可用于導(dǎo)航的設(shè)計(jì)空間。回歸系數(shù)的值（3）如表3所示，所有的系數(shù)均顯著（P<0.05），包括線性項(xiàng)系數(shù)（X1，X2和X3），交互項(xiàng)的系數(shù)（X1X2，X1X3和X2X3），和二次項(xiàng)系數(shù)（X12，X22和X32）。經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ娃D(zhuǎn)化為三維（3D）和等高線圖來(lái)預(yù)測(cè)的自變量和響應(yīng)之間的關(guān)系。3.2.2提取方法的優(yōu)化回歸公式的圖形由表三（3）中使用設(shè)計(jì)專家評(píng)估獨(dú)立變量的影響以及它們對(duì)PPLPs的提取效率的相互作用獲得的。在響應(yīng)面圖和等高線圖，PPLPs的提取效率有兩個(gè)連續(xù)變量研究沿，而另一個(gè)變量保持在其零電平。多糖的提取效率受提取溫度，水與原料的比例，并提取時(shí)間的影響結(jié)果如示圖2所示，.受提取溫度和水與原料比多糖的提取率示于圖2（a），并且（a1）具有固定在零電平（4小時(shí)）提取時(shí)間。提取溫度由85℃到89.35℃多糖的產(chǎn)量明顯增加。然而，除了89.35℃，提取率下降非常緩慢，隨著溫度上升。根據(jù)提取溫度和提取時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖顯示在圖2（b）和（b1）的水到原料固定比率在零電平（30：1）。多糖產(chǎn)量的增加可以顯著伴隨提取溫度的增加而增加。提取率隨著時(shí)間的增加，從3小時(shí)到4.5小時(shí)迅速增加。然而，除了4.5小時(shí)，的時(shí)間?；谒c原料比例和提取時(shí)間的響應(yīng)面和等高線圖顯示在圖2（c）和（c1）與提取溫度固定在零電平（90℃）。它表明，水與原料的比率為20：1至26：1時(shí)，多糖的產(chǎn)率提高。然后用水與原料的比例下降26：1到40：1的提取率增加非常緩慢。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和重復(fù)分析，提取多糖的最佳工藝條件如下：提取溫度90.83℃，水與原料的比例21.3：1和提取時(shí)間4.8小時(shí)。在三種測(cè)試的獨(dú)立變量中，根據(jù)二次多項(xiàng)式模型（表3）和梯度的回歸系數(shù)意義顯示，萃取溫度是影響多糖的產(chǎn)率最顯著因素，其次是提取時(shí)間，水與原料的比例斜率在響應(yīng)面圖（圖2）。圖2.響應(yīng)面圖和等高線圖顯示出的變量對(duì)PPLPs的提取率的影響（X1：提取溫度，X2：水與原料配比和X3提取時(shí)間）。3.3預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證驗(yàn)證模型方程的充足程度，適合用于預(yù)測(cè)最佳值選擇的最佳的條件下進(jìn)行了測(cè)試。如表4中所示，優(yōu)化的提取條件為提取溫度90.83?C，水與原料的21.3：1的比例，提取時(shí)間4.8小時(shí)，PPLPs的預(yù)測(cè)的良品率是54.24％。以確保該預(yù)測(cè)結(jié)果不偏于實(shí)用價(jià)值，三驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了修改后的最佳條件下：提取溫度90.8?C，水與原料的21.3：1的比例，并提取時(shí)間4.8小時(shí)。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)量PPLPs的是54.18％和接近該預(yù)測(cè)值。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值之間沒(méi)有差異顯著并確認(rèn)響應(yīng)模型準(zhǔn)確和充分的PPLPs的提取。3.4多糖的分離與純化PPLPs分別在最佳條件下制備，用乙醇沉淀，脫蛋白，并凍干。將粗多糖，褐色的粉末，呈現(xiàn)負(fù)碘-碘化鉀反應(yīng)，這表明不存在淀粉型多糖。PPLPs經(jīng)DEAE-纖維素DE52柱色譜純化。如圖3，主峰洗脫用0.3摩爾/升的NaCl溶液。主要部分（PPLP）收集，濃縮，透析，凍干的抗氧化活性進(jìn)一步研究。PPLP出現(xiàn)，為淺黃色粉末，并表現(xiàn)出對(duì)茚三酮試驗(yàn)否定響應(yīng)。UV光譜在260和280nm處檢測(cè)到?jīng)]有吸收的事實(shí)，暗示PPLP不含有核酸和蛋白質(zhì)。3.5抗氧化活性的研究3.5.1對(duì)DPPH自由基清除活性DPPH自由基是穩(wěn)定的自由基，多糖已被廣泛用于評(píng)估天然化合物的自由基清除活性。DPPH的乙醇溶液在517納米處具有特征吸收的最大值。當(dāng)DPPH乙醇溶液降低，吸光度降低，并且從紫色溶液變?yōu)闇\黃色。清除DPPH自由基的機(jī)制的原理是以DPPH引起的天然化合物可以傳輸電子或氫原子[16]?；谶@一原理，進(jìn)行PPLP對(duì)DPPH自由基清除活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4（a)所示。的PPLP的清除能力呈劑量依賴性。PPLP的清除效果從7.62％提高到84.73％時(shí)的PPLP的濃度分別為0.05毫克/毫升增加到0.9毫克/毫升。PPLP和抗壞血酸清除DPPH自由基半數(shù)抑制效果（IE50）值分別為0.25和0.06毫克/毫升。PPLP的清除活性比抗壞血酸低，而類似的結(jié)果已經(jīng)表明在其他植物多糖中[17]。3.5.2羥基自由基清除活性在活性氧反應(yīng)中，羥基自由基被認(rèn)為是一個(gè)可以很容易地穿過(guò)細(xì)胞膜的生物大分子，是最容易最有效的氧化劑，如碳水化合物，蛋白質(zhì)，脂類，和DNA。羥基自由基可以引起相鄰的生物分子嚴(yán)重?fù)p害或細(xì)胞死亡[18]。因此，清除羥基自由基對(duì)生物系統(tǒng)的保護(hù)極為重要?；贔enton反應(yīng)的原理，確定PPLP對(duì)羥基自由基的清除作用，結(jié)果顯示在圖4（b）。PPLP羥自由基的清除作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。在1毫克/毫升的濃度下，測(cè)定多糖對(duì)羥自由基和抗壞血酸的清除作用，清除率結(jié)果分別是79.04%和91.98%，PPLP和抗壞血酸為清除羥自由E50值分別為0.31和0.25毫克/毫升。結(jié)果表明，PPLP有很強(qiáng)的清除羥基自由基的作用，且接近抗壞血酸的能力?？赡艿臋C(jī)制可涉及的任一個(gè)電子或氫原子由多糖的供應(yīng)，它可以與羥基自由基相結(jié)合而形成穩(wěn)定的化合物，以終止自由基鏈反應(yīng)。另一種抗氧化劑機(jī)制可能是由于供給任一個(gè)電子或氫原子由多糖，其可以結(jié)合與自由基離子如Fe2+和Cu2+的。這些機(jī)制暗示的PPLP可以充當(dāng)電子或氫供體，以清除羥自由基[19]。3.5.3超氧陰離子自由基清除活性超氧陰離子自由基被認(rèn)為是作為一個(gè)初始自由基和由線粒體的電子傳遞體系形成。它除了直接攻擊一些生物分子外，超氧陰離子自由基還可降解來(lái)創(chuàng)建其它基團(tuán)，如羥基，單線態(tài)氧，和過(guò)氧化氫，這可以觸發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用和誘導(dǎo)病理事件，如關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默氏病[20]。因此，清除超氧陰離子自由基的研究是必要的。超氧陰離子自由基由PMS/NADM系統(tǒng)測(cè)定在NBT的還原產(chǎn)生離子。PPLP對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果圖4（c）。PPLP的清除活性，隨后的PPLP清除活性呈劑量依賴的方式在所有測(cè)試的濃度。在濃度為1.0毫克/毫升時(shí)，PPLP和抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用分別為76.09％和94.78％，此外，PPLP和抗壞血酸清除超氧陰離子的IE50值分別為0.35和0.17毫克/毫升。結(jié)果表明，PPLP有明顯的超氧自由基清除活性。然而，PPLP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用比抗壞血酸低。結(jié)論RSM被證實(shí)為對(duì)于PPLPs的優(yōu)化的最有用工具之一。最佳變量如下：萃取的溫度為90.8℃；水與原料的比例為21.3：1；提取時(shí)間為4.8小時(shí)。在這些條件下，實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)率是54.18％，這與預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)良好。此外，PPLP是經(jīng)DEAE纖維素-52陰離子交換層析得到的淺黃色粉末。PPLP有很強(qiáng)的體外抗氧化活性。因此，PPLP作為一種新的潛在的抗氧化劑有一定的探索價(jià)值，并且進(jìn)一步的研究，以評(píng)估在體內(nèi)抗氧化活動(dòng)，并闡明其抗氧化機(jī)制至關(guān)重要。

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