分子生物學第一章緒 論

一、分子生物學的基本含義分子生物學是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當前生命科學中發(fā)展最快并正在與其它學科廣泛交叉與滲透的重要前沿領域。所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對遺傳、

生殖、生長和發(fā)育等生命基本特征的分子機理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎和提供新的手段。當前第1頁\共有56頁\編于星期五\17點分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細胞內(nèi)、細胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分子。生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊藏各種信息，并且具有復雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。闡明這些復雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關系是分子生物學的主要任務。當前第2頁\共有56頁\編于星期五\17點Mendel的遺傳因子階段摩爾根的基因階段順反子階段現(xiàn)代基因階段一、基因的發(fā)展當前第3頁\共有56頁\編于星期五\17點Mendel的遺傳因子階段Mendel提出：生物的某種性狀是由遺傳因子負責傳遞的。是顆粒性的，體細胞內(nèi)成雙存在，生殖細胞內(nèi)成單存在。遺傳因子是決定性狀的抽象符號。1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨立分配規(guī)律；1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)當前第4頁\共有56頁\編于星期五\17點1909年丹麥遺傳學家Yohannsen(1859-1927)發(fā)表了“純系學說”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遺傳因子”的概念。但沒有提出基因的物質(zhì)概念。當前第5頁\共有56頁\編于星期五\17點Morgan的基因階段MorganT.H.等提出了基因的連鎖遺傳規(guī)律。說明了基因是在染色體上占有一定空間的實體。基因不再是抽象符號，被賦予物質(zhì)內(nèi)涵。當前第6頁\共有56頁\編于星期五\17點順反子階段1957年，本澤爾（SeymourBenzer）以T4噬菌體為材料，在DNA分子水平上研究基因內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)，提出了順反子（cistron）概念。順反子是1個遺傳功能單位，1個順反子決定1條多肽鏈。當前第7頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第8頁\共有56頁\編于星期五\17點現(xiàn)代基因階段操縱子（operon）：結(jié)構(gòu)基因+調(diào)控元件+調(diào)節(jié)基因LacOperon當前第9頁\共有56頁\編于星期五\17點2．跳躍基因

指DNA能在有機體的染色體組內(nèi)從1個地方跳到另一個地方，它們能從1個位點切除，然后插入同一或不同染色體上的另一個位置。3．斷裂基因

1個基因被間隔區(qū)分成不連續(xù)的若干區(qū)段，這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因被稱為斷裂基因。4．假基因

不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因

。5．重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的即重疊的。當前第10頁\共有56頁\編于星期五\17點1983年，McClintock由于在50年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動遺傳因子（jumpinggene或稱mobileelement）而獲得Nobel獎。BarbraMcClintock當前第11頁\共有56頁\編于星期五\17點1993年，美國科學家Roberts和Sharp因發(fā)現(xiàn)斷裂基因(introns)而獲得Nobel獎當前第12頁\共有56頁\編于星期五\17點Gene的定義“基因”的分子生物學定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。Agenecanbedefinedasfollowing:

TheentirenucleicacidsequencethatisnecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptideorRNAmolecule.當前第13頁\共有56頁\編于星期五\17點分子生物學發(fā)展簡史當前第14頁\共有56頁\編于星期五\17點19世紀后期到20世紀50年代初，是現(xiàn)代分子生物學誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點對生命本質(zhì)的認識上的重大突破.確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎物質(zhì)確定了DNA是生物遺傳的物質(zhì)基礎一、準備和醞釀階段當前第15頁\共有56頁\編于星期五\17點19世紀末Buchner兄弟證明酵母無細胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細胞色素C、肌動蛋白等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)生命的許多基本現(xiàn)象（物質(zhì)代謝、能量代謝、消化、呼吸、運動等）都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系，可以用提純的酶或蛋白質(zhì)在體外實驗中重復出來。在此期間對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認識也有較大的進步。1902年EmilFisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發(fā)展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結(jié)晶X-線衍射分析技術的發(fā)展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)模型。所以在這階段對蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認識。當前第16頁\共有56頁\編于星期五\17點遺傳物質(zhì)是核酸的確定肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗噬菌體侵染細菌實驗煙草花葉病毒的重建實驗當前第17頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第18頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第19頁\共有56頁\編于星期五\17點結(jié)論：加熱殺死的S型菌有某種轉(zhuǎn)化因子當前第20頁\共有56頁\編于星期五\17點Avery在1944年更精密的實驗設計提取可能的轉(zhuǎn)化因子：DNA、RNA、蛋白質(zhì)、莢膜進行試驗分別用降解DNA、RNA、蛋白質(zhì)的酶作用于S型菌細胞抽提物組分提純試驗結(jié)果：DNA組分純度越高，轉(zhuǎn)化效率越高。結(jié)論：使R型菌變?yōu)镾型菌的物質(zhì)是S型菌的DNA當前第21頁\共有56頁\編于星期五\17點Avery在1944年的報告中這樣寫道：當溶液中酒精的體積達到9/10時，有纖維狀物質(zhì)析出；如稍加攪動，這種物質(zhì)便會像棉線繞在線軸上一樣繞在硬棒上，溶液中的其他成分則以顆粒狀沉淀留在下面。溶解纖維狀物質(zhì)并重復沉淀數(shù)次，可提高其純度。這一物質(zhì)具有很強的生物學活性，初步實驗證實它很可能就是DNA。當前第22頁\共有56頁\編于星期五\17點T2噬菌體感染試驗

（1952年，Hershey&Chase）

當前第23頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第24頁\共有56頁\編于星期五\17點病毒重建試驗雜種病毒的感染特征和蛋白質(zhì)外殼的特性是由其中的RNA決定的，而不是蛋白質(zhì)決定的當前第25頁\共有56頁\編于星期五\17點結(jié)論證明核酸（DNA或RNA）是遺傳的物質(zhì)基礎簡單的細菌（或病毒）解決復雜而重大的問題微生物與高等生物具有共同的遺傳本質(zhì)當前第26頁\共有56頁\編于星期五\17點二、現(xiàn)代分子生物學的建立和發(fā)展階段當前第27頁\共有56頁\編于星期五\17點1962年，Watson和Crick因為在1953年5月25日的《Nature》提出DNA的反向平行雙螺旋模型而與Wilkins共獲Noble生理醫(yī)學獎，后者通過X射線衍射證實了Watson-Crick模型。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。1、DNA雙螺旋模型的提出當前第28頁\共有56頁\編于星期五\17點TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962：fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial.

當前第29頁\共有56頁\編于星期五\17點Wilkins通過對DNA分子的X射線衍射研究證實了該模型。RosalindE.Franklin1920-1958當前第30頁\共有56頁\編于星期五\17點被遺忘的英格蘭玫瑰

RosalindE.Franklin1920-1958當前第31頁\共有56頁\編于星期五\17點在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時，Watson和Crick就提出DNA復制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素標記和超速離心分離實驗為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復制模型；1972年證實了DNA復制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓撲異構(gòu)酶，并對真核DNA聚合酶特性做了分析研究。

完善了對DNA復制機理的認識3、中心法則和操縱子學說的提出當前第32頁\共有56頁\編于星期五\17點以Nireberg等為代表的一批科學家經(jīng)過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了64個密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。當前第33頁\共有56頁\編于星期五\17點在研究DNA復制將遺傳信息傳給子代的同時，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質(zhì)過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiegelman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補；逐步闡明了RNA轉(zhuǎn)錄合成的機理。當前第34頁\共有56頁\編于星期五\17點

1968年，Nirenberg，Holley和Khorana共享諾貝爾生理醫(yī)學獎Nirenberg：破譯DNA遺傳密碼；Holley：闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸序列，并證實了所有tRNA具有結(jié)構(gòu)上的相似性；Khorana：第一個合成了核酸分子，并且人工復制了酵母基因。當前第35頁\共有56頁\編于星期五\17點中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀后修正的“中心法則”當前第36頁\共有56頁\編于星期五\17點1961年，法國科學家Jacob和Monod提出并證實了操縱子（operon）作為調(diào)節(jié)細菌細胞代謝的分子機制。他們還推測存在一種與DNA序列相互補、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場所并翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的mRNA（信使核糖核酸）。對分子生物學的發(fā)展產(chǎn)生了極其重要的指導作用。當前第37頁\共有56頁\編于星期五\17點FrancoisJacob(Left),JacquesMonod(Center)&AndreLwoff(Right),1965分享了諾貝爾生理醫(yī)學獎當前第38頁\共有56頁\編于星期五\17點三、初步認識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段當前第39頁\共有56頁\編于星期五\17點工具酶的發(fā)現(xiàn)和應用1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了EcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。1967年，世界上有五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，完善了中心法則，用于構(gòu)建cDNA文庫。1.重組DNA技術的建立和發(fā)展當前第40頁\共有56頁\編于星期五\17點1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII；1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了EcoRI一類重要的限制性內(nèi)切酶。當前第41頁\共有56頁\編于星期五\17點1967年，世界上有五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。當前第42頁\共有56頁\編于星期五\17點1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶。當前第43頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第44頁\共有56頁\編于星期五\17點載體的發(fā)現(xiàn)及其應用載體主要是小分子量的復制子如：病毒、噬菌體、質(zhì)粒。1972年，美國Stanford大學的P.Berg等首次成功地實現(xiàn)了DNA的體外重組；pSC101質(zhì)粒載體，ColE1質(zhì)粒載體，pBR322質(zhì)粒載體，pUC質(zhì)粒載體，pGEM-3Z質(zhì)粒，穿梭質(zhì)粒載體，pBluescript噬菌粒載體etc.當前第45頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第46頁\共有56頁\編于星期五\17點在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；具有單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質(zhì)粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標記；含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。當前第47頁\共有56頁\編于星期五\17點 LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導該基因表達，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶相互補，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍色。當前第48頁\共有56頁\編于星期五\17點重組子導入受體細胞技術1944年，肺炎鏈球菌被成功轉(zhuǎn)化。1970年，大腸桿菌才被成功轉(zhuǎn)化，得益于CaCl2的應用當前第49頁\共有56頁\編于星期五\17點轉(zhuǎn)化定義：同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的基因轉(zhuǎn)移過程。感受態(tài)細胞：具有攝取外源DNA能力的細胞。當前第50頁\共有56頁\編于星期五\17點當前第51頁\共有56頁\編于星期五\17點自然遺傳轉(zhuǎn)化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力:枯草芽孢桿菌：20%細胞出現(xiàn)感受態(tài)，持續(xù)幾小時；肺炎鏈球菌：培養(yǎng)后100%細胞為感受態(tài)；、大腸桿菌不能出現(xiàn)自然的感受態(tài)狀態(tài)。必備條件：1.建立了感受態(tài)的受體細胞；2.外源游離DNA分子。當前第52頁\共有56頁\編于星期五\17點人工轉(zhuǎn)化在自然轉(zhuǎn)化的基礎上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術。不是由細菌自身的基因所控制；用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高，因為質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化多數(shù)情況下不涉及重組過程。當前第53頁\共有56頁\編于星期五\17點2、基因組研究的發(fā)展分子生物學已經(jīng)從研究單個