血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹培訓(xùn)課件

血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹主要內(nèi)容中心簡(jiǎn)介核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及工作流程核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理和檢測(cè)關(guān)鍵控制點(diǎn)開站核酸檢測(cè)情況2血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹江西省血液中心概況

江西省血液中心于1984年成立，隸屬省衛(wèi)生廳管理的公共衛(wèi)生事業(yè)單位。占地面積63.4畝，總建筑面積21788㎡,現(xiàn)有職工171人，供應(yīng)省直13家醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床用血，2011年總供血量為23.8噸，并承擔(dān)全省采供血機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)、業(yè)務(wù)技術(shù)指導(dǎo)、人才培訓(xùn)及血液相關(guān)的科研等任務(wù)。自2006年起，臨床用血已實(shí)現(xiàn)100%來(lái)自于自愿無(wú)償獻(xiàn)血。成分輸血達(dá)到99.8%。

3血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹中心重視科研工作，致力從臨床輸血治療和開展新技術(shù)治療的需求出發(fā)，開展了血液去除白細(xì)胞、血漿病毒滅活等新技術(shù)。2010年4月份，中心與北京、上海、廣州等12個(gè)省市15所采供血機(jī)構(gòu)一道，被衛(wèi)生部列為我國(guó)內(nèi)地首批核酸檢測(cè)試點(diǎn)單位。此外，中心先后開展了骨髓移植配血、器官移植配型(基因法)、產(chǎn)前血型血清學(xué)檢測(cè)、新生兒溶血病檢測(cè)、親子鑒定(基因法)等研究工作。

4血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹中心核心價(jià)值觀忠誠(chéng)履行輸血使命

精益服務(wù)健康人生5血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹中心環(huán)境6血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹標(biāo)本交接離心區(qū)：用于核酸標(biāo)本的接收、離心處理；設(shè)備：大容量低溫離心機(jī)2臺(tái)混樣區(qū)：用于血液標(biāo)本開蓋、混樣、以及質(zhì)控品的加樣；設(shè)備：全自動(dòng)混樣儀HAMILTONSTARIVD2臺(tái)、生物安全柜1臺(tái)、移動(dòng)紫外車3臺(tái)；提取擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)：用于核酸的提取、PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。設(shè)備：3套COBAS?AmpliPrep+COBAS?TaqMan、服務(wù)器1臺(tái)、試劑暫存冰箱1臺(tái)、移動(dòng)紫外車3臺(tái)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置7血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

實(shí)驗(yàn)室平面圖

8血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹檢測(cè)系統(tǒng)：

cobass201核酸血液篩查系統(tǒng)設(shè)備配置：

2STAR+3CAP+3docking+3CTM試劑組成：

cobas?TaqScreenMPXTest（96人份，一代）

cobas?TaqScreenMPXControlKit（一代：6*6）

cobas?TaqScreenWashReagent9血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹全血標(biāo)本標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理。樣本離心后先進(jìn)行常規(guī)酶免檢測(cè)，然后將酶免試劑陰性結(jié)果標(biāo)本進(jìn)行六混樣核酸檢測(cè)。如混樣檢測(cè)有反應(yīng)性，再進(jìn)行拆分檢測(cè)。機(jī)采標(biāo)本標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理；加樣模式：六混樣（1機(jī)采標(biāo)本+5全血標(biāo)本）核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程10血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)（酶免第一批陰性）23.0008.0009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.00核酸檢測(cè)（酶免第二批陰性）核酸檢測(cè)（酶免第三批陰性）酶免檢測(cè)第一批2staffsStartNAT酶免檢測(cè)第二批酶免檢測(cè)第三批核酸檢測(cè)如有陽(yáng)性結(jié)果，當(dāng)天進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程11血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本拆分實(shí)驗(yàn)03.0004.0006.0019.0020.0021.0022.0023.0024.0001.0002.001staff05.0007.00全部樣本在48小時(shí)內(nèi)出報(bào)告，符合衛(wèi)生部核酸檢測(cè)要求核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程12血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)—標(biāo)本采血管的選擇留樣方式及注意事項(xiàng)運(yùn)輸過(guò)程中標(biāo)本質(zhì)量保證標(biāo)本處理方式及細(xì)節(jié)解讀標(biāo)本檢測(cè)13血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)采血管的要求抗凝劑：首選EDTA和枸櫞酸鹽，避免使用肝素抗凝。無(wú)菌無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶：含分離膠的真空采血管；14血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹標(biāo)本留取細(xì)節(jié)解讀防污染留取人員的個(gè)人防護(hù)，留取前的清潔消毒，留取過(guò)程中保持密閉，防止其他可能污染物。充分混勻注意樣品采集后的充分混勻，一般上下顛倒５次以上，如操作不規(guī)范，則容易出現(xiàn)凝塊，給后續(xù)檢測(cè)帶來(lái)弊端：核酸檢測(cè)出現(xiàn)凝塊報(bào)錯(cuò)，引起人力、試劑等不必要的浪費(fèi)，增加標(biāo)本污染風(fēng)險(xiǎn)。標(biāo)本量標(biāo)本留取應(yīng)檢查是否足量，如量少，應(yīng)更換采血管重新留取，杜絕開蓋留取。15血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹NAT標(biāo)本溶血及影響溶血：原因多為標(biāo)本留取中機(jī)械作用致紅細(xì)胞破裂引起，如標(biāo)本留取不暢、留取速度過(guò)快等；另外，劇烈震蕩也可引起溶血，如運(yùn)輸顛簸等溶血對(duì)NAT檢測(cè)的影響：血紅蛋白是核酸檢測(cè)的主要抑制物之一，可抑制核酸檢測(cè)；另外可核酸酶的釋放加速核酸降解。如何避免溶血現(xiàn)象出現(xiàn)？標(biāo)本留取時(shí)將血液順管壁緩慢注入真空管中；另外避免震蕩，以防血細(xì)胞破裂而溶血。

16血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹NAT標(biāo)本脂血及影響脂血是指血液標(biāo)本采集后，經(jīng)過(guò)離心處理，分離出來(lái)的血清中含有脂類物質(zhì)。從外觀上看，血漿呈渾濁的乳白色。脂血對(duì)NAT檢測(cè)的影響：脂血易引起加樣環(huán)節(jié)液面感應(yīng)異常報(bào)錯(cuò)；高脂血標(biāo)本可通過(guò)對(duì)熒光的屏蔽和吸收作用而干擾檢測(cè)。如何避免留取脂血標(biāo)本？應(yīng)注意飲食情況等的征詢，可一定程度消除留取脂血標(biāo)本。17血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹NAT標(biāo)本中的其它影響因素內(nèi)源性：免疫球蛋白、蛋白酶、離子等；外源性：肝素抗凝劑、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材中含有的抑制物等。18血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹標(biāo)本的運(yùn)輸冷鏈控制專用標(biāo)本運(yùn)輸箱的使用；確保標(biāo)本在采集后4小時(shí)內(nèi)離心。19血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹檢測(cè)前準(zhǔn)備檢測(cè)前核對(duì)：狀態(tài)、標(biāo)識(shí)、離心時(shí)間、保存條件等；室溫平衡：如標(biāo)本在4℃中保存，檢測(cè)前應(yīng)室溫平衡30分鐘以上（非常重要，否則易產(chǎn)生clot）；開蓋：加樣前開蓋；在生物安全柜中進(jìn)行；21血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹加樣過(guò)程中凝塊報(bào)錯(cuò)原因分析采血后混勻不充分：局部抗凝效果不佳致凝塊析出；離心條件不充分：離心力或離心時(shí)間不足所致，如血漿中存在的微量血細(xì)胞、分離膠、纖維蛋白等為引發(fā)凝塊的原始因素。加樣前室溫平衡時(shí)間不足。加樣設(shè)備問(wèn)題：為假凝塊，多為設(shè)備感應(yīng)異常、設(shè)備硬件與軟件的兼容性欠缺等原因引起，可通過(guò)調(diào)整參數(shù)、軟件兼容性等方法解決；22血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸標(biāo)本的采集、運(yùn)送、處理和保存的關(guān)鍵點(diǎn)采血管：抗凝劑、一次性密閉、無(wú)菌、無(wú)核酸酶及其他擴(kuò)增抑制物采集：人員、防污染、采集方式標(biāo)本的運(yùn)送：冷鏈控制？盡可能快？標(biāo)本的處理：離心時(shí)間、離心強(qiáng)度，4小時(shí)內(nèi)離心合格標(biāo)本:外觀質(zhì)量符合要求、容器完整、量夠、23血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)—防污染措施核酸檢測(cè)的最大特點(diǎn)是具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力與極高的靈敏度，這也意味著極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性結(jié)果。24血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹易引發(fā)NAT檢測(cè)污染的幾個(gè)環(huán)節(jié)標(biāo)本的開蓋NAT檢測(cè)試劑、外部質(zhì)控品的準(zhǔn)備擴(kuò)增產(chǎn)物的處理用品的專用與清潔（如手套、紗布等），25血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹《基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》規(guī)定：……在核酸純化過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染……為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。26血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹Rochecobass201系統(tǒng)防污染設(shè)計(jì)全球唯一的三重防污染設(shè)計(jì)儀器：全自動(dòng)封閉系統(tǒng)反應(yīng)管：全程封閉狀態(tài)，杜絕交叉污染試劑：專利的UNG酶消除擴(kuò)增產(chǎn)物帶來(lái)的污染27血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹移動(dòng)紫外燈照射；

70%乙醇；日常儀器和架子的維護(hù)清潔新鮮配置的0.5%次氯酸鈉溶液；

實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)面和樣本外濺時(shí)使用實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)其他實(shí)驗(yàn)室防污染措施28血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹溫度在15-30度之間，超出這個(gè)范圍儀器報(bào)警；注意除濕，濕度不宜超過(guò)60%，超過(guò)這個(gè)濕度儀器故障率高。核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)—溫度與濕度29血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)管理嚴(yán)格單向工作流向制度

進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析；各區(qū)在物理空間上完全互相獨(dú)立，使用功能上互相分割；各區(qū)之間不能有空氣直接相通。嚴(yán)格物品專用制度

各區(qū)使用的儀器設(shè)備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號(hào)筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。各工作區(qū)域用品必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。30血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹分區(qū)內(nèi)操作流程的合理化了解實(shí)驗(yàn)室污染的來(lái)源，可能產(chǎn)生污染的實(shí)驗(yàn)操作（如陽(yáng)性樣本、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每一次的開蓋過(guò)程等）操作順序應(yīng)盡量從相對(duì)清潔到相對(duì)污染（如混樣區(qū)相對(duì)清潔度：檢測(cè)耗材>標(biāo)本>陽(yáng)性質(zhì)控品),操作順序顛倒時(shí)應(yīng)及時(shí)更換手套或進(jìn)行相應(yīng)的處理；養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)室操作習(xí)慣，規(guī)范行為。避免攜帶污染操作人員應(yīng)注意防止通過(guò)頭發(fā)、眼鏡等非專用物品將污染物攜帶到清潔區(qū)；警惕手套可能接觸污染物或污染其它物品等。31血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹2010年8月9日--2013年7月31日共完成177916份血液標(biāo)本的核酸檢測(cè)。其中拆分檢測(cè)586次；拆分出390例酶免陰性而NAT陽(yáng)性的標(biāo)本，陽(yáng)性率為0.22%。鑒別陽(yáng)性標(biāo)本190例，其中188例為HBV陽(yáng)性，另有1例HBV、HCV合并感染,1例HCV陽(yáng)性。血站開展核酸檢測(cè)情況32血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹檢測(cè)常見現(xiàn)象分析問(wèn)題1：初混陽(yáng)性，拆分陰性標(biāo)本如何解釋？因根據(jù)檢測(cè)CT值、擴(kuò)增曲線等綜合判斷，一般CT值在37以上可考慮為初混時(shí)產(chǎn)生了假陽(yáng)性反