內(nèi)源保護(hù)酶測定方法

內(nèi)源保護(hù)酶測定方法一、藥品與試劑配置：磷酸緩沖液配備（PBS）母液A（PbA）:0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4?2H2O31.2g用蒸餾水定容至1000ml。138/156母液B（PbB）:0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4?12H2O71.62g用蒸餾水定容至1000ml。268.1/358.1酶液制取酶液提取液的配備:50mMPH7.0（PBS）PbA97.5ml+PbB152.5ml定容到1000ml酶液提取時(shí)，配制成含1%聚乙烯毗咯烷酮（PVP）的50mMPH7.0PBS（現(xiàn)配現(xiàn)用）配制方法：稱取1g聚乙烯毗咯烷酮溶100ml50mMPH7.0PBS中3.丙二醛（皿0）測定TCA-TBA混合液制備：101.25g三氯乙酸（TCA）+2.5g硫代巴比妥酸（TBA） 加熱溶解，冷卻后定容到500ml。（注：先溶解TCA,再溶解TBA）4.過氧化物酶（POD）測定POD反應(yīng)液制備：0.2MPH6.0PBS:PbA87.7ml+PbB12.3ml定容至1000ml0.2MPH6.0PBS50ml+29%H2O20.028ml+愈創(chuàng)木酚0.019ml（注：現(xiàn)配現(xiàn)用，冰箱保存）5.過氧化氫酶（CAD—高錳酸鉀滴定法50mMPH7.0PBS同上250mMH2O2 1ml30%H202定容至100ml10%H2SO4 110ml濃硫酸定容至2000ml4mMKMnO4 1.264gKMnO4溶于2000ml水中超氧化物岐化酶（SOD）測定一氮藍(lán)四唑（NBT）法50mMPH7.8PBS：PbA10.625ml+PbB114.375ml定容至500ml130mmol/LMet（甲硫氨酸）：1.9399gMet用50mMPH7.8PBS定容至100ml。750四mol/LNBT: 0.06133gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。100|imol/LEDTA-Na2:0.018605gEDTA-Na2用PBS定容至500ml.20四mol/L核黃素： 0.03765g用水定容至500ml，避光保存?？扇苄缘鞍诇y定0.2g考馬斯亮藍(lán)G-250,溶于100ml95%乙醇中，再加入200ml85%H3PO4,用水定容至2000ml。二、實(shí)驗(yàn)步驟與計(jì)算方法2.酶液制取準(zhǔn)確稱取葉片0.5g,置于研缽中，先加4ml含1%聚乙烯毗咯烷酮（PVP）的50mMPH7.0PBS,在冰浴下研磨成漿，然后再用6mlPBS（分兩次，一次3ml）沖洗干凈，移入離心管內(nèi)，16000xg冷凍離心20min，然后取上清液保存，置于冰箱中備用。全部測定結(jié)束后量剩余酶液體積，并計(jì)算酶液總體積。3.丙二醛（訶人）測定（1） 操作步驟：在10ml離心管中，先加入4mlTCA-TBA混合液，然后加入1ml酶液，沸水浴中20min后，立即冰水浴中冷卻4000xg離心10min，上清液測OD532和OD600。（用制取酶液時(shí)所用緩沖液代替酶液作為空白對照）（2） 計(jì)算方法:MDA（四molgFW-1）=（OD532-OD600）x12.903x酶液總體積（ml）/鮮重g4.過氧化物酶（POD）測定（1） 操作步驟2支試管一支加3mlPOD反應(yīng)液，并以制取酶液時(shí)所用緩沖液代替酶液作為空白對照八、、，另一支加3mlPOD反應(yīng)液+10四1酶液混勻后OD470比色注：每隔1分鐘讀數(shù)一次，讀6-10次，根據(jù)酶活性高低可增加或減少反應(yīng)酶液量。（2） 計(jì)算方法以每分鐘光密度變化值表示酶活性大小。單位Unit：^OD470g-1FW-min-1或^OD47Qmg-1pr-min-1=8D470x酶液總體積ml/稱樣重W/所用酶液體積5.過氧化氫酶（CAT）-高錳酸鉀滴定法（1） 操作步驟在試管中加入4ml50mMPH7.0PBS，然后加入100^1酶液，再加入1ml50mMH2O2，塑料膜封口，30笆水浴保溫10min，加2ml10%H2SO4終止反應(yīng)，然后倒入三角瓶（或試管）中并沖洗十凈，用4mMKMnO4滴定剩余H2O2，至出現(xiàn)粉色。 （以制取酶液時(shí)所用緩沖液代替酶液作空白對照）（2） 計(jì)算方法CAT活性=（空白滴定體積ml-樣品滴定體積ml）x4x2.5x酶液總體積ml/樣品重g/反應(yīng)時(shí)間min/反應(yīng)用酶液ml單位：H2O2四molgFW-1-min-1超氧化物岐化酶（SOD）測定一氮藍(lán)四唑（NBT）法（1） 操作步驟在玻璃試管中，分別加入以下試劑：50mMPH7.8PBS1.5ml,130mmol/LMet（甲硫氨酸）0.3ml,750|imol/LNBT0.3ml,100四mol/LEDTA-Na20.3ml,20四mol/L核黃素0.3ml,加入酶液0.05ml,加水0.25ml。最終體積為3ml。（對照管以制取酶液時(shí)所用緩沖液代替酶液作為空白對照）做2組對照，一組置暗處，另一組與樣品管一起4000lx日光下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，溫度高時(shí)受光時(shí)間縮短，低時(shí)延長），反應(yīng)結(jié)束以不照光對照管做空白，分別測定其它各管吸光度（OD560）（2） 計(jì)算方法SOD活性=（OD照光對照管一OD樣品管）x酶液總體積x2/OD照光對照管/樣品重/測定所用酶液量可溶性蛋白測定（1）測定方法玻璃試管中，加入0.1ml酶液，然后加入0.9ml水，再加入5ml考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置2min，OD595比色。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作稱取0.01g牛血清蛋白，溶于水定容至100ml，制成0.01g/100mlPr標(biāo)準(zhǔn)液。具體方法：取六支試管，按下表加入試劑，混合均勻后，向各管中加入5ml考馬斯亮藍(lán)G—250，搖勻靜置2min鐘后，OD595下測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。符號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水