生物技術制藥講解之抗體制藥

生物技術制藥講解之抗體制藥

第一節(jié)

概述

1、1890年Behring和北里柴三郎等人發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素血清，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。因為是被動免疫，雖然治療效果很好，但不持久。．

2、1937年Tiselius等人用電泳法將血清分為白蛋白、甲種（α）球蛋白、乙種（β）球蛋白、丙種（γ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。抗體指能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。它是機體免疫系統(tǒng)受抗原物質刺激后，B淋巴細胞被活化、增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗體活性及化學結構與抗體相似的球蛋白，稱為免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）。

Ig是化學結構的概念，而抗體是生物學功能的概念，所有抗體是Ig，但并非所有Ig分子都有抗體活性。生物技術制藥講解之抗體制藥

3、1960年發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細胞有多種免疫球蛋白。由于病原微生物是含有多種抗原決定族的抗原物質，因此制的這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱為多克隆抗體。易出現(xiàn)非特異性交叉反應。

4、1975年K?hlerandMilstein等首次利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出McAb.在臨床上主要用于診斷和治療。McAb由一個B細胞克隆產(chǎn)生的，只能識別某一個抗原表位的高度特異性抗體。

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McAb在免疫導向療法中存在的困難（障礙）：

A、McAb均是鼠源性抗體，應用于人體內可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應，在人體內的半衰期只有5~6h，難以維持有效藥物作用靶組織時間；

B、完整的抗體分子的相對分子質量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。解決問題的方法或途徑—基因工程技術

A、降低McAb的免疫源性；

B、降低McAb的相對分子質量。生物技術制藥講解之抗體制藥5、1984年報道了人—鼠嵌合抗體，之后制備出了改型抗體、單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位等多種類型，基本上消除了抗體的鼠源性（免疫源性），相對分子質量只有完整抗體分子的1/80~1/3。

6、1994年Winter創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術,以基因工程方法制備抗體并發(fā)展成抗體工程。它是抗體研究領域的一次技術革命，它不用人工免疫動物和細胞融合技術，完全用基因工程技術制備人源性抗體。生物技術制藥講解之抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體及其改造（MonoclonalAntibody）一、制備單克隆抗體的一般流程

McAb是將抗體產(chǎn)生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產(chǎn)生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，故稱為單克隆抗體。生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥

1、抗原與動物免疫免疫方法：體內免疫和體外免疫抗原：顆粒性抗原和可溶性抗原免疫動物：BALB/c小鼠和Lou大鼠

2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)

基本方法：取適量脾細胞（1×108）與骨髓瘤細胞（2×107~3×107）進行混合，在PEG作用下誘導它們融合，時間控制在2min以內，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥

用于細胞融合的骨髓瘤細胞的條件：1、融和率高2、自身不分泌抗體3、所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定。生物技術制藥講解之抗體制藥PEG的相對分子質量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細胞的毒性也隨之增大。常用濃度為40%~50%，相對分子質量4000為佳。相對分子質量在400~6000，濃度在10%~60%范圍內的PEG都能使細胞發(fā)生融合。

為了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亞砜），以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴格限制接觸時間。（1）細胞融合液中的細胞類型：4或5種。（2）如何去除脾-瘤融和細胞以外的細胞？常用選擇性培養(yǎng)基生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥

細胞融合后，可產(chǎn)生多種融合細胞，如脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤的融合細胞，而且還有許多未融合的骨髓瘤細胞。這些細胞比脾—瘤融合的雜交瘤細胞增殖更快，并能將其淘汰。為此，可再將融合后的細胞立即移入選擇性培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是用次黃嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶配制的。其中氨基喋吟(A)能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤—瘤融合細胞和瘤細胞因不能合成DNA而死亡。脾—脾融合細胞和瘤細胞在這樣的組織培養(yǎng)條件下，幾天內亦迅速死亡。由于骨髓瘤細胞都是次黃嘌吟鳥嘌吟磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺乏株，脾細胞內卻有這種酶，因此脾—瘤融合的雜交瘤細胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌吟(H)和胸腺嘧啶合成DNA，使雜交瘤細胞得以生長。生物技術制藥講解之抗體制藥

在最適的培養(yǎng)條件下．大約有105個脾細胞才能形成一個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個或少數(shù)的雜交瘤細胞多半不易存活。

在體外的細胞培養(yǎng)中，單個的或數(shù)量很少的細胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細胞才能使其生長繁殖，加入的細胞稱之為飼養(yǎng)細胞。所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞和胸腺細胞等。一般認為飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還能清除死亡細胞，故應用的較多。生物技術制藥講解之抗體制藥3、篩選陽性克隆與克隆化常用的檢測方法：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術常用的克隆化方法：有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法：把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板，使每孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。軟瓊脂法：在培養(yǎng)液中加入0.5%的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用吸管吸出，移入96孔板培養(yǎng)。

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篩選陽性克隆與克隆化

因為抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5％左右，所以要進行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進行克隆化培養(yǎng)。并檢測大批標本。免疫酶技術因不需進行放射性核素操作，方法簡便，又適于檢測大批標本等優(yōu)點而被廣泛采用。通過引入生物素—親和素等放大系統(tǒng)可進一步提高靈敏性。一般說來免疫酶技術和放射免疫技術均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫熒光技術適用于細胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標本為目的的抗體時，免疫熒光法則更有意義，在篩選抗體的同時，還能對所識別的抗原進行定位判定。下面以酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選抗破傷風毒素抗體為例進行說明。

生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥4、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定—染色體分析

正常鼠的脾細胞染色體數(shù)：40，全部為端著絲粒。小鼠骨髓瘤細胞染色體：SP2/0細胞為62~68，NS-1為54~64，有中部和亞中部著絲點。

雜交瘤細胞的染色體數(shù)目：接近兩親本細胞染色體數(shù)目的總和，在結構上多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。

染色體數(shù)目多且較集中的雜交瘤細胞分泌高效價的抗體；反之，則反。生物技術制藥講解之抗體制藥5、單克隆抗體的大量制備（1）體外培養(yǎng)法：用于抗原免疫性極弱獲得的抗體較少。多采用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%--20%胎?；蛐∨Ｑ?。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達100μg/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質量差異太大，直接影響雜交瘤細胞的生長。改良的方法有：無血清培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體懸浮培養(yǎng)法。無血清培養(yǎng)法：利用白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。懸浮培養(yǎng)法：連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細胞密度可達2×107/ml,收集的單克隆抗體可達400μg/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細胞密度可達108/ml。生物技術制藥講解之抗體制藥（2）動物體內誘生法：用于抗原免疫性較強。常用基本程序：接種前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射1*106雜交瘤細胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細胞沉淀，取上清液凍存。優(yōu)點：操作簡便，比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體量多且效價高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株。缺點：小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。生物技術制藥講解之抗體制藥6、單克隆抗體的純化根據(jù)Ig的類和亞類以及用途選擇不同的純化方法。體外診斷試劑IgG類沉淀處理+親和層析

IgM類沉淀處理+凝膠過濾體內診斷試劑或治療用藥親和層析+陰離子交換層析，并注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。

生物技術制藥講解之抗體制藥動物體內誘生法制備的McAb純化的一般程序：

（1）澄清和沉淀處理：a.1000g離心5min，去除沉淀物（紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊和脂質）b.20000g高速離心30min,去除殘留的小顆粒物質c.用0.2μm微孔濾膜過濾，去除細菌、支原體d.飽和硫酸銨沉淀抗體（50%飽和硫酸銨能回收90%以上的抗體）。

生物技術制藥講解之抗體制藥（2）分離

A、凝膠過濾：用于IgG和IgM類。常用SephadexG200作為分離介質，可收集到3個峰，最高峰為IgM，另外兩個峰為IgG。抗體回收率達50~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。

B、陰離子交換層析：用于IgG類的分離純化。在條件下，IgG1和IgG2能結合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強度下洗脫下來，其純度很高。IgG2b和IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。

C、親和層析：多用蛋白A親和層析。適用于IgG類。IgG類與蛋白A的結合與pH有密切的關系。鼠源性單抗在時，IgG2b、IgG3幾乎全部結合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用緩沖液可洗脫下IgG2b，緩沖液可洗脫下IgG3，緩沖液可洗脫下IgG2a，可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度和很高，但也有極微量的雜蛋白。生物技術制藥講解之抗體制藥二、鼠源性單克隆抗體的改造

目的：一是降低免疫源性；

二是降低相對分子量，增加組織通透性。

原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），生物功能則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。

生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥鼠源性單克隆抗體的改造

1、人—鼠嵌合抗體（chimericantibody）：把鼠源性單克隆抗體的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的C區(qū)基因連接，即成為人—鼠嵌合抗體的基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達出完整的ChimericAntibody.2、改型抗體(Reshapingantibody)：用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中的CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結合特異性。抗體分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。這種改型抗體也稱CDR移植抗體(CDRgraftingantibody)。

3、小分子抗體：小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質量僅為原抗體的1/80~1/3。

(1)Fab片段抗體：VH+CH1(3)單鏈抗體：VH-Linker-VL(2)FV抗體：VH+VL(4)單域抗體：VH或VL（5）最小識別單位（MRU）：單個CDR區(qū)構成

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4、雙功能抗體：雙特異性抗體(bispecificantibody,BsAb)。是一種非天然性抗體，其結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。

5、抗體融合蛋白：從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。是20世紀90年代發(fā)展的研究領域。類型如下：（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.

（2）配基—Ig型嵌合抗體，如IL-2-Ig

（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受體—FV型融合蛋白（5）酶—抗體型融合蛋白（abeneyme,抗體酶）生物技術制藥講解之抗體制藥第三節(jié)抗體工程抗體研究的三個階段：①以1890年Behring發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素為代表，其特點是用抗原免疫動物來獲得多克隆抗體；②以1975年K?hler創(chuàng)建雜交瘤技術制備單克隆抗體為代表；③以1994年Winter完全用基因工程技術制備人源性抗體，而且還能通過細菌發(fā)酵或轉基因動物或轉基因植物大規(guī)模生產(chǎn)抗體。在此基礎上發(fā)展成抗體工程。他創(chuàng)建了噬菌體抗體庫技術,克服了人體不能隨意免疫的缺點，用人外周血制備抗體文庫，從而獲得人源性基因工程抗體。生物技術制藥講解之抗體制藥

一、噬菌體抗體庫技術的基本方法

1、獲取目的基因

2、抗體庫技術的載體：

3、淘篩（panning）：

4、表達與鑒定：。生物技術制藥講解之抗體制藥

1．獲取目的基因提取RNA經(jīng)反轉錄PCR(RT—PCR)獲取抗體某一特定基因區(qū)段，如重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH、VL)基因?？贵w基因的組合形式多為單鏈抗體SCFV，也用連接鏈(G4S)3組合成功能分子。生物技術制藥講解之抗體制藥

2．抗體庫技術的載體現(xiàn)在普遍使用噬菌粒載體，它具有噬菌體和質粒的共同特點。因為它的轉化效率高有利于提高文庫容量?？贵w蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的形式表達在載體表面，再感染后，能使目的克隆得以擴增。琥珀終止碼在適當位置上引人載體是抗體庫的關鍵性技術。而克隆位點后的基因序列則有利于對可溶性表達產(chǎn)物的鑒定和純化。生物技術制藥講解之抗體制藥

3．淘篩基本過程是，抗原固相化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復與抗原吸附……，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量地擴增。

4．表達與鑒定目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導入感受態(tài)菌株，進行可溶性表達。產(chǎn)物用Western-blot分析確定后，就完成了全過程。生物技術制藥講解之抗體制藥WesternBlotting免疫印跡WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥典型的印跡實驗包括三個步驟：

①蛋白質的電泳分離

②電泳后凝膠上的蛋白質轉移至固體膜上。

③免疫學檢測。生物技術制藥講解之抗體制藥二、噬菌體抗體庫技術的特點

1、模擬天然全套抗體庫：抗體文庫可以達到或超過1011庫容，所以能包含B細胞全部克隆。建庫的外源基因來自人體外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，這是人體多克隆細胞的總mRNA。使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性?？贵w的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性。

2、避開了人工免疫和雜交瘤技術：由于抗體庫的大容量和極高的篩選效率，使得可以調出任意抗體基因，用基因工程方法制備抗體，因而能避免使用人工免疫動物和細胞融合技術。

3、可獲得高親和力的人源化抗體：在噬菌體抗體庫技術中，VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程，所用的抗體基因又來自人體，因此，所產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的人源化抗體。生物技術制藥講解之抗體制藥三、基因工程抗體的表達在篩選出陽性克隆后，按其目的不同，可選用原核細胞、真核細胞、轉基因植物和動物等不同表達方式進行表達。

1．原核細胞表達抗體表達，又分融合表達和分泌型表達兩種。融合表達有利于對抗體文庫進行淘篩，且有利于對克隆和抗體活性進行鑒定。分泌型表達則利用琥珀終止密碼的終止作用，在無琥珀抑制基因的菌株中進行表達，形成的可溶性抗體就是應用抗體。生物技術制藥講解之抗體制藥無義突變的三種昵稱，三個終止密碼子UAA叫赭石密碼子；UAG叫琥珀密碼子；UGA叫蛋白石密碼子。琥珀突變（AAG→UAG）就是當ORF中的一個密碼子突變?yōu)殓晷徒K止子后，生物體采取了一種措施，原來此密碼子對應的反密碼子也突變?yōu)榕c琥珀密碼子配對，從而是ORF閱讀后的產(chǎn)物和突變后的產(chǎn)物一樣．這樣就對突變進行了抑制．生物技術制藥講解之抗體制藥

2．真核細胞表達用于表達基因工程抗體的真核細胞有酵母、昆蟲細胞、中國倉鼠卵細胞和真菌等，而且這些細胞的表達都是分泌型表達。

3．轉基因植物表達抗體基因能轉入植物中表達，這方面研究較多且潛力較大的是煙草葉中的表達．表達的抗體稱為植物抗體。目前完整的抗體分子、單鏈抗體和Fab片段均已在煙草葉和擬南芥菜植物中得到表達，其產(chǎn)量可達植物葉片總蛋白量1．3％，其高表達產(chǎn)量使抗體成本大幅度下降，而且轉基因植物表達可使抗體大規(guī)模農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)。

4．轉基因動物表達即將人的Ig基因組轉移到動物體內，讓動物產(chǎn)生人源化抗體。目前只在單基因水平上做轉基因鼠的實驗，大的基因片段的轉移難度很大。生物技術制藥講解之抗體制藥

第四節(jié)抗體藥物一、抗體診斷試劑二、抗體治療藥物生物技術制藥講解之抗體制藥

一、抗體診斷試劑

抗原抗體特異性結合，在體內和體外均可呈顯某種反應。在體內，可表現(xiàn)為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學診斷和血型測定，稱為血清學鑒定。抗體診斷藥物基本分為三類：1、血清學鑒定抗體制劑。2、免疫標記技術用的抗體制劑。3、體內導向診斷抗體制劑。習慣上體外試驗用的稱試劑，體內導向診斷用的稱藥物。

生物技術制藥講解之抗體制藥1、血清學鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑

A、常用診斷血清的品種和用途

B、診斷血清的制備步驟

a、制備細菌抗原：細菌接種培養(yǎng)收集菌苔-沸水制成菌液。

b、免疫動物和制備抗體血清：抗原稀釋后免疫動物：家兔、馬、羊、豚鼠。免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數(shù)3-7次，每次間隔3-4d，末次注射后6-8d取血樣測效價，達到要求，即可采血，離心分離血清。

C、診斷血清的診斷方法：直接凝集反應，鏡檢生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑

A、試劑制備原理：紅細胞經(jīng)甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質，當純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結合而使血細胞發(fā)生凝集。

B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠獲得抗HBs血清硫酸銨鹽析/柱層析取其IgG在醋酸緩沖液中致敏醛化血細胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。

C、診斷方法：RPHA（reversepassivehemagglutination)反向被動血凝試驗，即用純化的抗體致敏醛化血細胞測定相應抗原在V型血凝板上進行，陰性樣品不凝集，血細胞沉積于V型孔底部，呈尖點狀；陽性樣品血細胞凝集成塊狀。

生物技術制藥講解之抗體制藥（3）妊娠診斷試劑

婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3個月內可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕（4）抗ABO血型系統(tǒng)血清生物技術制藥講解之抗體制藥為保證輸血的安全，供血者和受血者均需檢驗血型并做血交叉反應。血型有多個系統(tǒng)，其中重要的是ABO血型系統(tǒng)。按人紅細胞表面帶有的A或B種凝集原．可將血型分為A、B、AB和O型4種。單克隆抗體是應用B淋巴細胞雜交瘤技術生產(chǎn)抗A或抗B血清，以鑒別ABO血型。但單克隆抗體持異性極高，而血型物質又太復雜，易得出錯誤的結果，其陰性結果往往不能說明沒有該血型物質，需用多株單克隆抗體混合才能克服這一缺點。但用單克隆抗體進行血型物質組成的研究，則是有用的工具。血型鑒定的方法，最常用的是玻片直接凝集方法生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥2、免疫標記技術用的抗體類試劑給抗體標記核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現(xiàn)，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機制提供手段。

（1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。（2）免疫酶抗體診斷試劑：用酶標記抗體檢驗抗原的方法

a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診斷試劑

b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診斷試劑

c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑

d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑

e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑用于原發(fā)性肝癌的輔助診斷

f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑用于消化道惡性腫瘤的鑒別診斷生物技術制藥講解之抗體制藥

免疫酶抗體診斷技術免疫酶技術是用酶標記抗體來檢測抗原的方法。

(1)免疫酶染色法（酶標抗體）酶標抗體與抗原發(fā)生特異性結合，當加人酶的底物時，底物在酶的催化作用下發(fā)生反應，產(chǎn)生有色物質。該物質不需特殊儀器，在光學顯微鏡下即能觀察。目前常用的酶是辣根過氧化物酶，底物為二氨基聯(lián)苯胺．兩者作用可生成棕褐色沉淀物，使玻片上的抗原所在部分呈色。生物技術制藥講解之抗體制藥

(2)酶免疫測定法酶免疫測定是在液相內微量待檢抗原物質的定量測定方法。用酶標記已知抗體或抗免疫球蛋白(抗抗體)，與待查抗原混合形成抗原抗體結合物后，加入酶的底物進行顯色，根據(jù)呈色程度使用分光光度計測知待測物質的含量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELSA)是酶免疫測定在方法上的一個重大改進，其特點是利用抗原或抗體等蛋內質容易吸附于聚苯乙烯塑料等表面的性質，使抗原抗體反應在塑料管(孔)壁表面上進行，簡化了抗原抗體結合物的分離手續(xù)。本法用途廣泛，敏感性高，既可定性檢測微量抗原，也可定量測定微生物成分、激素等微量抗原物質。生物技術制藥講解之抗體制藥生物技術制藥講解之抗體制藥（3）放射免疫用抗體診斷試劑

把核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質。

常用的標記抗體試劑：

a、HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度0.1ng/ml

。e抗原為陽性表明病毒正在大量的繁殖，而且病毒數(shù)量比較的多，傳染性強，需要馬上治療。c、HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記

d、AFP放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素標記抗體診斷試劑：125I標記，靈敏度1ng/生物技術制藥講解之抗體制藥3、導向診斷藥物由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導向藥物還未在臨床廣泛應用。生物技術制藥講解之抗體制藥（1）．放射免疫顯像的優(yōu)點：①在體內有確切定位腫瘤的作用．準確性可達90％以上，靈敏度幾乎達100％。②在體內可檢出0．5cm大小的病灶，并可檢出肺、腦等部位的轉移灶。③小分子抗體容易到達腫瘤部位，可明顯提高T(腫瘤組織)／NT(非腫瘤組織)值。④抗體在腫瘤部位，可保留6—9日。⑥能觀察抗體在血中的半衰期和出現(xiàn)的不良反應。生物技術制藥講解之抗體制藥（2）．放射免疫顯像定位技術

是將抗腫瘤單克隆抗體(Ab)與二乙基三胺五乙酸(DTPA)在體外偶聯(lián)，再注人體內，就能與腫瘤組織結合。由于抗體分子量較大，這一過程需3天才能完成。3天后注入半衰期短的放射性核素In—113(半衰期100min)。由于原先注入的DTPA是重金屬離子絡合劑，所以In—113就可以結合到DTPA分子上，從而使腫瘤組織顯像。這一過程在2h之內即可完成。該技術具有簡單、方便的優(yōu)點，可在導向診斷中發(fā)揮更大的作用。生物技術制藥講解之抗體制藥

二、抗體治療藥物（體內用藥物）抗體治療藥物的研究已有20多年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤相關的抗原。但治療用的制劑尚沒有一種達到商品化的程度。在治療藥物中，單克隆抗體與毒素的偶聯(lián)物治療淋巴瘤效果最佳，但有效率僅30%。目前的客觀現(xiàn)實是：研究進展迅速，但未達到常規(guī)治療的應用階段。障礙（原因）：抗體相對分子質量大，穿透力低，不能達到靶部位或攝取量低。鼠源性抗體的排斥反應。

生物技術制藥講解之抗體制藥(一)、放射性核素標記的抗體治療藥物

抗體作為放射性核素的導向載體，在人體內應用是比較成功的。放射性核素標記抗體的操作簡便，放射性核素和抗體的用量小，且能觀察到藥物在體內的分布和藥物動力學，故應用前景好。研究結果證明，1、放射性核素標記的抗體有較大的殺傷范圍，這有利于克服腫瘤表面抗原的異質性，對腫瘤細胞的殺傷也不依賴抗原抗體結合后的吸收作用。2、放射性核素標記的抗體的分子量小，更容易穿透到達腫瘤部位。因此，放射免疫治療是導向治療中活躍的領域。其缺點是有些放射性核素來源困難，且需放射性保護和污物處理。生物技術制藥講解之抗體制藥(二)、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物

1．常用的抗癌藥物

主要有氨甲喋吟、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、新抑癌蛋白和正定霉素等。以人血清白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的藥物量，使體外細胞毒性提高2倍，抗體藥物偶聯(lián)物對化學療法耐藥的細胞株仍然有效。生物技術制藥講解之抗體制藥2．抗體類藥物逆轉耐藥性

腫瘤細胞對藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)。MDR是由基因調控的，其編碼蛋白稱為P糖蛋白，其中P170是與腫瘤耐藥相關的主要蛋白，有l(wèi)280個氨基酸殘基．相對分子質量為170一180kd的跨膜蛋白。在細胞膜內折疊成6對，形成通道結構，胞漿側有2個ATP結合區(qū)。目前認為P糖蛋白是ATP酶依賴性的藥泵，藥物進入細胞后與P糖蛋白結合，利用ATP水解釋放的能量將藥物泵出胞外，使胞內藥物蓄積減少，因而產(chǎn)生耐藥性。

腫瘤細胞多藥耐藥性(multidrugresistance)的產(chǎn)生是導致腫瘤化療失敗的主要原因之一。生物技術制藥講解之抗體制藥針對腫瘤MDR的產(chǎn)生過程，應用多藥耐藥逆轉是解決腫瘤MDR的主要手段。研究發(fā)現(xiàn)大量具有MDR逆轉活性的化合物,主要包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米及其衍生物)、鈣調蛋白抑制劑(噻吩嗪類化合物)、免疫抑制劑(環(huán)孢菌素A及其衍生物)、類固醇和激素類似物(黃體酮、甲地孕酮）還有天然藥物（中藥）多藥耐藥逆轉劑、反義寡核苷酸、

核酶、RNA干擾等。但多藥耐藥逆轉劑的毒副作用也使其臨床應用受到限制生物技術制藥講解之抗體制藥(三）毒素偶聯(lián)的抗體藥物

(1)毒素的來源目前主要來源是細菌毒素和植物毒素。常用的有以下幾種：白喉毒素（DT)、綠膿桿菌外毒素(PE)、產(chǎn)氣莢膜桿菌磷脂酶(PLC)、蓖麻毒素(RT)等。生物技術制藥講解之抗體制藥(2)載體

載體主要作用是將毒素攜帶至靶細胞表面，并與其結合，使毒素進入細胞內起作用。載體的相對分子質量要小，識別與結合靶細胞能力強，特異性好。生物技術制藥講解之抗體制藥CD4細胞是人體免疫系統(tǒng)中的一種重要免疫細胞，在T細胞的表面。這些CD4細胞又稱為免疫系統(tǒng)的輔助手（helper），能指揮身體對抗微生物和病毒。由于艾滋病病毒攻擊對象是CD4細胞，所以其檢測結果對艾滋病治療效果的判斷和對患者免疫功能的判斷有重要作用。正常成人的CD4細胞在每立方毫米500個到1600個，艾滋病病毒感染者的CD4細胞下降，標志著免疫系統(tǒng)受到嚴重損害，當CD4細胞小于每立方毫米200個時，可能發(fā)生感染或腫瘤。生物技術制藥講解之抗體制藥(3)制備方法

先克隆出毒素基因，再利用基因重組技術去除毒素中非特異性細胞結合部位基因。經(jīng)過改造的毒素基因與載體重組，轉入受體菌表達，形成融合蛋白，經(jīng)過純化得到重組免疫毒素。生物技術制藥講解之抗體制藥（4）免疫毒素