限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)課件

關(guān)于限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)第1頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA特定堿基序列的核酸水解酶。這些酶都是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的，可以為宿主抵御外來(lái)DNA的侵襲。根據(jù)酶的切割特性、催化條件及是否具有修飾性可分為I、II、III型三大類。I型酶具有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四種活性。其內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)和切割部位不一致，無(wú)固定的切割位點(diǎn)，不產(chǎn)生特異片斷。III型酶和I型酶類似，也有甲基化功能，但無(wú)ATP酶和DNA解旋酶活性。此類酶可在DNA鏈的特異位點(diǎn)切割，但切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，對(duì)基因工程的意義也不大。第2頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、核酸限制性內(nèi)切酶II型酶就是通?；蚬こ讨惺褂玫腄NA限制性內(nèi)切酶。II型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶組成。II型限制酶需要Mg2+作為催化反應(yīng)輔助因子，能識(shí)別雙鏈DNA的特定序列，一般為4-6個(gè)堿基的反轉(zhuǎn)重復(fù)序列。II型限制酶一般在識(shí)別序列內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片斷。II型修飾酶識(shí)別和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是負(fù)責(zé)對(duì)識(shí)別序列的甲基化修飾。第3頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、核酸限制性內(nèi)切酶II型限制酶切割DNA雙鏈可產(chǎn)生三種不同的DNA末端：平末端、5’端突出的粘性末端、和3’端突出的粘性末端。BamHI識(shí)別及切割位點(diǎn)：

5’…G↓GATCC…3’3’…CCTAG↑G…5’↓5’…G3’ 5’GATCC…3’3’…CCTAG5’ 3’G…5’XhoI識(shí)別及切割位點(diǎn)：5’…C↓TCGAG…3’3’…GAGCT↑C…5’第4頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)配制反應(yīng)體系DNA：必須具備一定純度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢劑、及高鹽的存在均將影響限制性內(nèi)切酶的活性。DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的重要因素。反應(yīng)緩沖液：不同廠家、不同的酶都有不同的最佳反應(yīng)條件。應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。雙酶切時(shí)要選擇兩種酶都具有最高活性的緩沖液。反應(yīng)容積：在DNA濃度<0.4μg/μl的情況下，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的反應(yīng)容積。過(guò)高濃度的DNA會(huì)使溶液過(guò)于粘稠影響酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。第5頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)配制反應(yīng)體系內(nèi)切酶及使用的酶量根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇限制性內(nèi)切酶。1個(gè)酶活力單位的定義：在50μl反應(yīng)體系中，1μgDNA在推薦的反應(yīng)緩沖液和溫度下反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，被完全酶切所需要的內(nèi)切酶的量。過(guò)量的酶可縮短反應(yīng)時(shí)間。但使用過(guò)多的酶將導(dǎo)致識(shí)別序列特異性下降。一般采用2-10倍的酶量。加入酶的總?cè)莘e不能超過(guò)反應(yīng)體系總?cè)莘e的10%。否則甘油終濃度將達(dá)到5%以上，將抑制酶的活性。第6頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)酶切溫度及時(shí)間：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明確定最佳反應(yīng)溫度。反應(yīng)時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以免內(nèi)切酶產(chǎn)生星活性。星活性（StarActivity）：是指限制性內(nèi)切酶在某些反應(yīng)條件產(chǎn)生的識(shí)別并切割非特異序列位點(diǎn)的現(xiàn)象。其結(jié)果是酶切條帶增多。星活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與酶過(guò)量、甘油濃度過(guò)高，pH值不合適、離子濃度過(guò)低、酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等有關(guān)。酶切時(shí)間比增加酶量更易產(chǎn)生星活性。第7頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)終止反應(yīng)：可以通過(guò)以下3種方式終止酶切反應(yīng)：若DNA在酶切后不進(jìn)行進(jìn)一步的酶反應(yīng)時(shí)，可加入EDTA至終濃度10mM，或加入0.1%SDS。EDTA對(duì)酶的滅活徹底，但EDTA存在將使連接反應(yīng)變得極為困難。若DNA在酶切后須進(jìn)行下一步的酶反應(yīng)，可將反應(yīng)產(chǎn)物置65℃或80℃加熱20分鐘。但有些酶加熱滅活不徹底。用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。酶切結(jié)果的鑒定酶切完成后，取適量反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結(jié)果。第8頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、實(shí)驗(yàn)步驟按順序，在1.5ml微量離心管中配制反應(yīng)試劑：10XBuffer 5μlDNA(~100ng/μl)（質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物） 44μlBamHI(15Units/μl) 0.5μlXhoI(10Units/μl) 0.5μl混勻試劑。將離心管置37℃水浴，反應(yīng)1小時(shí)。第9頁(yè)，講稿共11頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、實(shí)驗(yàn)步驟瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段制備1%瓊脂糖凝膠。在每個(gè)酶切反應(yīng)管中加入1/10體積10X上樣緩沖液，混勻。將樣品平均加入2個(gè)加樣孔內(nèi)，每個(gè)孔加樣27.5μl。135V衡壓電泳30-40分鐘。在紫外燈下