菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定

菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定第1頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容菌落總數(shù)測定大腸菌群測定MPN法原理（拓展內(nèi)容）第2頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定掌握菌落總數(shù)測定方法實驗原理 不同稀釋度的樣品，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)第3頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定器材與試劑：樣品，無菌生理鹽水，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿第4頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定第5頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月傾注培養(yǎng)第6頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)結(jié)果第7頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定實驗步驟

5.菌落計數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記必要時分區(qū)計數(shù)，菌落成片者作廢計算方法某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)第8頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定計算方法：（2）有兩個稀釋度在30-300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結(jié)果單位：CFU/ml（g）第9頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落總數(shù)測定注意事項：

1.無菌操作

2.標(biāo)記

3.何時更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

6.安全常識第10頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定實驗?zāi)康膶嶒炘?/p>

36℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法：初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯

1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管第11頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球第12頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定實驗步驟：

1.初發(fā)酵

第13頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月吸取樣品方法第16頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月加注樣品第17頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月初發(fā)酵結(jié)果右邊為陽性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。第18頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取產(chǎn)氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)：36℃，48h

（4）觀察指標(biāo)：若產(chǎn)氣則報告大腸菌群陽性。第19頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍(lán)平板：

45℃，無菌，傾注，15ml

（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍(lán)平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)：36℃，48h第20頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基第21頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第22頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月分區(qū)劃線法操作要點

1.劃下一個區(qū)前必須滅菌接種環(huán)

2.劃線時接種環(huán)同平板呈30-40°角

3.每次劃線應(yīng)該壓到上一個區(qū)域的2-3條線

4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動第23頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

2.分離培養(yǎng)：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落第24頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭染色法器材與試劑結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙第25頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭染色法涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：通過火焰若干次初染：結(jié)晶紫一滴，1min，水洗媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，30s或至無色為止復(fù)染：復(fù)紅一滴，30s第26頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月涂片第27頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月熱固定第28頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月初染第29頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月媒染第30頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月脫色第31頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)染第32頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法第33頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管第34頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定實驗步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（3）培養(yǎng)：37℃，24h

（4）觀察指標(biāo)：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣第35頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月液體接種第36頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)發(fā)酵復(fù)發(fā)酵陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生第37頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群數(shù)測定注意事項：

1.無菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養(yǎng)