微生物的實驗室培養(yǎng)課件(同名4)

老師的幾點希望1、按時出勤，不要人間仙界來回穿梭，更不要四海八荒到處溜達(dá)2、上課要帶著元神來，不要只有仙體在3、老師會把十幾年的修為毫無保留滴渡給你，幫你渡劫4、自己要努力，爭取順利飛升上神，最起碼也要上仙，千萬不要應(yīng)劫、掛科5、學(xué)好這門課，收益三生三世，收獲十里桃林到目前為止，幾十項Nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎，化學(xué)獎都與微生物學(xué)有關(guān)課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用獲得純凈培養(yǎng)物的要領(lǐng)：為需要培養(yǎng)的微生物提供合適的生存條件（即營養(yǎng)和環(huán)境條件）阻止和抑制其它微生物的生長一、基礎(chǔ)知識：（一）生存條件——培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基（是否添加凝固劑：瓊脂）（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)化學(xué)成分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基用途鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運動、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進(jìn)所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長back半固體培養(yǎng)基：(是否運動)

無動力有動力(彌散)固體培養(yǎng)基：菌落微生物需要的五大類營養(yǎng)要素物質(zhì)是：微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)及功能1.碳源2.氮源3.水

4.無機鹽5.生長因子（非必需）：凡是能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。①無機碳源：CO2；NaHCO3等②有機碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等①構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)微生物的能源⑴.概念⑵.來源：⑶.作用：1.微生物的碳源2、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成自養(yǎng)生物異養(yǎng)生物①無機氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠為微生物提供N元素的營養(yǎng)物質(zhì)。主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。2.微生物的氮源⑴.概念：⑵.來源：⑶.作用：3.生長因子⑶.常見的生長因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生長不可缺少的微量有機物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。碳源、氮源、生長因子的比較來源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是異養(yǎng)做生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分思考：下表是對四種生物的能源、碳源、氮源、新陳代謝類型的描述，正確的一組是（）選項比較項目硝化細(xì)菌乳酸菌根瘤菌衣藻A能源NH3乳酸N2光能B碳源CO2葡萄糖葡萄糖CO2C氮源NH3N2N2NO3-D代謝類型自養(yǎng)需氧型異養(yǎng)厭氧型自養(yǎng)需氧型自養(yǎng)需氧型葡萄糖NH4+異養(yǎng)需氧型B葡萄糖3、培養(yǎng)基配制原則：

（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細(xì)菌pH為：6.5-7.5；放線菌pH為：7.5-8.5；真菌pH為：5.0-6.0。1.無菌技術(shù)的概念無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。⑴消毒定義：利用較溫和的物理或化學(xué)方法，殺死部份微生物的過程。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別⑵滅菌的定義：

使用強烈的理化因素消滅所有微生物，包括芽孢和孢子，而達(dá)到完全無菌。

二者的作用原理一致：使蛋白質(zhì)變性來抑制微生物生命活動或者殺死微生物防止外來雜菌的入侵（二）無菌技術(shù)

①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min

②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min

③化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒；氯氣消毒水源④紫外線消毒：照射30min⑴.消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法①灼燒滅菌②干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。③高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.⑵.滅菌的方法：1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考二、實驗操作（以培養(yǎng)大腸桿菌為例）大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細(xì)菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢。主要生活在大腸內(nèi)。屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運載體。大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。由于具有體積小、結(jié)構(gòu)簡單、易培養(yǎng)、生活周期短、變異類型容易選擇等優(yōu)點，常做為遺傳學(xué)研究的實驗材料。㈠.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1.計算2.稱量3.溶化4.滅菌:

將錐形瓶放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。5.倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種。二、實驗操作（以培養(yǎng)大腸桿菌為例）倒平板操作1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染，又可以避免培養(yǎng)基表面的水分地?fù)]發(fā)。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。㈡.純化大腸桿菌平板劃線法和稀釋涂布平板法。微生物的接種的常用接種方法有：

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的菌落比較小，大多數(shù)表面光滑粘稠霉菌的菌落特征因種而異菌落霉菌的菌落常呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，有的表面還能呈現(xiàn)紅、褐、綠、黑、黃等不同孢子的顏色㈡.純化大腸桿菌平板劃線法和稀釋涂布平板法。微生物的接種的常用接種方法有：1.平板劃線的操作方法平板劃線的操作一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)則的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落；劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：線條末端細(xì)菌的數(shù)目較少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。2.稀釋涂布平板的操作方法問題討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。4.菌種的保存接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。3.微生物的恒溫培養(yǎng)⑵.長期保存：甘油冷凍管藏法⑴.臨時保藏：3.微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存三.結(jié)果分析與評價㈠.培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。㈡.接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。㈢.是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。四、課題成果評價

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法本課題知識小結(jié):【典例解析】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是A正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不