人源性單克隆抗體和基因工程抗體課件

四、人源性單克隆抗體

和基因工程抗體1四、人源性單克隆抗體

和基因工程抗體11.EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)：

利用類似于皰疹病毒的EB病毒在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞（來源于淋巴結(jié)、扁桃體、臍帶血、外周血等），使之轉(zhuǎn)化獲得永生能力得到人B淋巴細(xì)胞系，這些細(xì)胞可在體外分泌人抗體。(一)、人源性單克隆抗體21.EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)：(一)、人源性單克隆抗體2技術(shù)同鼠－鼠雜交瘤，親本骨髓瘤細(xì)胞主要有來自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，來自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；親本B細(xì)胞來源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但人－鼠雜交瘤的單克隆抗體分泌性能不穩(wěn)定，多數(shù)情況下由于人染色體的丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞失去分泌抗體的能力。

2.人－鼠雜交瘤單克隆抗體：3技術(shù)同鼠－鼠雜交瘤，親本骨髓瘤細(xì)胞主要3.人－人雜交瘤單克隆抗體：人－人雜交瘤操作步驟基本上與小鼠－小鼠雜交瘤技術(shù)相同，使用人的骨髓瘤細(xì)胞與人的B淋巴細(xì)胞融合；但可供利用的人骨髓瘤細(xì)胞種類非常有限，人的骨髓瘤細(xì)胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤細(xì)胞，而且人不能像小鼠那樣進(jìn)行高度免疫，B淋巴細(xì)胞常限于取自外周血(小鼠取自動物脾臟)，激活狀態(tài)不適合做融合；故人－人雜交瘤細(xì)胞在融合、融合后的篩選以及融合細(xì)胞分泌抗體方面仍不理想。43.人－人雜交瘤單克隆抗體：人－人4.構(gòu)建轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠?將改造過的人的抗體基因組導(dǎo)入小鼠胚胎，得到在免疫后能產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。改造過的抗體除了構(gòu)成抗原識別與抗原結(jié)合部位的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。?用人Ig基因組取代小鼠Ig基因組獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，以后僅需免疫小鼠制作單克隆抗體，但獲得的是人抗體而非小鼠抗體。該技術(shù)難度較大，但已有成功的報(bào)道。54.構(gòu)建轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠?將改造過的人的抗體基因組5.嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體：SCID小鼠具有嚴(yán)重免疫缺陷，對外源組織無免疫排斥反應(yīng)，故這種小鼠可接受人體組織或器官移植，形成人－鼠嵌合體小鼠。將人免疫干細(xì)胞移植到SCID小鼠體內(nèi)，SCID小鼠獲得了人的免疫系統(tǒng)。這種小鼠可用任何抗原免疫，從激活的淋巴細(xì)胞中富集抗原特異性人源性B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞融合或制備抗體庫。65.嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體：(二)、基因工程抗體

基因工程抗體是利用基因工程的手段獲得人源性抗體，主要包括以下幾個(gè)方面：人－鼠嵌合抗體、改型抗體、抗體片段、噬菌體抗體文庫技術(shù)、表位印跡選擇技術(shù)等。7(二)、基因工程抗體基因工程抗體是利用抗體的重輕鏈構(gòu)成的可變區(qū)(V區(qū))與識別抗原有關(guān)，具有特異性；而恒定區(qū)(C區(qū))與效應(yīng)功能有關(guān)。人－鼠嵌合抗體就是通過人工改造使抗體的V區(qū)是鼠源的，而C區(qū)是人源的。如此改造的嵌合抗體保留了原來鼠源單克隆抗體的特異性和親和力，人抗小鼠抗體反應(yīng)(HAMA)也明顯減弱。1.人－鼠嵌合抗體：8抗體的重輕鏈構(gòu)成的可變區(qū)(V區(qū))與識別人－鼠嵌合抗體的制備

9人－鼠嵌合抗體的制備92.改型抗體：

也稱CDR移植。用鼠源的CDR(可變區(qū)中和抗原互補(bǔ)結(jié)合構(gòu)成抗原結(jié)合部位的部分）取代人抗體中相應(yīng)的CDR部位，使得抗體中除構(gòu)成抗原結(jié)合部位的3個(gè)CDR是鼠源以外，其余均為人源。這種抗體在人體內(nèi)免疫性大大降低。102.改型抗體：也稱CDR移植。用鼠源改型抗體（CDR移植）11改型抗體（CDR移植）11

Fab抗體：抗體Y形的兩個(gè)臂稱為Fab，它由可變區(qū)和小部分的恒定區(qū)組成，利用基因工程的方法構(gòu)建具有可變區(qū)和小部分恒定區(qū)的Fab抗體，這樣的抗體仍具有特異結(jié)合抗原的特性。

單鏈抗體(ScFv)：用短肽接頭[常用(Gly4Ser)3]將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)相連，使其分子變小，更有利于穿透組織和清除，而且易構(gòu)建表達(dá)；但親和力會出現(xiàn)一定的下降。3.抗體片段：12Fab抗體：抗體Y形的兩個(gè)臂稱為Fab，它由可變區(qū)和小部分4.噬菌體抗體文庫技術(shù)體外建立一個(gè)相應(yīng)于體內(nèi)B細(xì)胞庫的抗體庫，從中篩選所需要的抗體。利用PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈的cDNA，并插入到噬菌體外殼蛋白的編碼基因中，然后感染E.coli，使抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物和外殼蛋白一起融合展示在噬菌體表面，成為噬菌體抗體。通過固相化的抗原進(jìn)行篩選，不能結(jié)合抗原的噬菌體被洗去，結(jié)合的噬菌體被洗脫下來再次感染細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，多次吸附－洗脫－擴(kuò)增后可獲得所要的抗原特異性的噬菌體抗體。這些抗體可以做到全部為人源的。134.噬菌體抗體文庫技術(shù)體外建立一個(gè)14145.表位印模選擇技術(shù)：用特定的已知抗原從抗體組合文庫中或噬菌體抗體文庫中篩選所需抗體，通過抗體可變區(qū)與抗原結(jié)合及編碼輕、重鏈可變區(qū)鼠源性與人源性基因置換、匹配，從而獲得能與抗原特異性反應(yīng)的人源性抗體，將篩選到的含人輕、重鏈基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到骨髓瘤SP2/0細(xì)胞中，該細(xì)胞即可產(chǎn)生人單克隆抗體。155.表位印模選擇技術(shù)：用特定的已