第二章-基因工程的工具酶

第二章基因工程的工具酶基因工程的工具酶（instrumentalenzymeofgeneengineering）是應用于基因工程各種酶的總稱，包括核酸序列分析、標記探針制備、載體構(gòu)建、目的基因制取、重組體DNA制備等所需要的酶類。1、限制性內(nèi)切酶2、甲基化酶3、DNA連接酶4、DNA聚合酶5、RNA聚合酶6、磷酸激酶和磷酸酶7、核酸酶8、核酶基因工程工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的切割特點限制性內(nèi)切酶的反應條件限制性內(nèi)切酶的應用細菌的限制—修飾作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle發(fā)現(xiàn)細菌的限制（restriction）現(xiàn)象：Phageλ（k）E.colikE.coliB[E.coliB限制λ（k）]感染不感染1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)E.Coli

菌株噬菌體感染率

k

B

CE.ColiK110-410-4E.ColiB10-4110-4E.ColiC111噬菌體侵染細菌lE.Coli

B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當λ(k)噬菌體侵染E.coli

B時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coli

B的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因為E.coliBphage對λ(K)進行了修飾。大腸桿菌B大腸桿菌K修飾的phageλ(B)修飾的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修飾作用）R-M系統(tǒng)細菌中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，構(gòu)成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng)(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系統(tǒng)是細菌安內(nèi)御外的積極措施。細菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解DNA，為避免自身DNA的降解，細菌可以修飾（甲基化酶）自身DNA，未被修飾的外來DNA則會被降解。個別噬菌體在被降解之前已經(jīng)發(fā)生了修飾，則可免予被降解。1968Linn和Arber從E.coliB中發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：在細胞內(nèi)能夠識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并對DNA分子進行切割的一種酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。2.限制性核酸內(nèi)切酶的分類主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處隨機性切割識別序列內(nèi)或附近特異性切割距識別序列下游24-26bp處在基因工程中意義無用非常有用意義不大EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號若種名頭2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。3.限制性核酸內(nèi)切酶的命名4.限制性核酸內(nèi)切酶的活性單位50μL反應體系中，含1μg底物DNA，于最適反應條件和溫度下，保溫1小時，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用U表示。

buffer（pH=8.0）：

50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巰基乙醇100μgBSA/ml

（DDT：二硫蘇糖醇BSA：牛血清蛋白)在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結(jié)果形成的DNA片段，具有互補的單鏈延伸末端。5.限制性核酸內(nèi)切酶的切割特點識別序列絕大多數(shù)的Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識別由4-8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。限制性核酸內(nèi)切酶就是從其識別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此這些識別序列又叫核酸內(nèi)切酶的切割位點或靶序列。識別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。ABCC’B’A’A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’ABB’A’ABB’A’或或EcoR

Ⅰ：5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’PstⅠ：5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC...…5’不同核酸內(nèi)切酶的特異識別位點切割位點AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAADNAABCDDNAHindⅢHindⅢ切割位點核酸內(nèi)切酶HindⅢ對雙鏈DNA分子的切割作用三種酶切末端平齊末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’5’粘性末端（如EcoRⅠ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’3’粘性末端（如PstⅠ）同裂酶和同尾酶同裂酶：來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。當胞嘧啶甲基化后，MspⅠ不能再切割。同尾酶：來源不同，識別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三種酶可產(chǎn)生相同的5’GATC粘性末端，由這種同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可因粘性末端的互補而彼此再連接起來。6.限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件1.底物DNA

（1）DNA純度:RNA影響，影響酶活性的有機溶劑、離子

（2）DNA濃度:

[DNA]過大，抑制酶活，影響酶分子擴散如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μL37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μL37℃1h（3）識別位點及鄰近位點特異性序列：如：pBR322DNA有4個NarⅠ切點(GGCGCC)，其中2個切點用1U酶水解1h完全切開，2個切點用50U酶水解16h水解不完全。又如XmaⅢ切點（CGGCCG）在GGCGGCCGCC時不切割。（4）DNA二級/三級結(jié)構(gòu)：如：超螺旋DNA(病毒或質(zhì)粒)比線狀DNA需酶多。（5）提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性：如：高濃度Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件

2.反應系統(tǒng)因素（1）緩沖液（無菌、無污染）（2）金屬離子：如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）則特異性改變。離子濃度不合適會抑制酶活。（3）牛血清蛋白(BSA)：BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量BSA會引起電泳拖尾限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件3.星活性限制性內(nèi)切酶識別特異性放寬。EcoRⅠ在正常情況下識別GAATTC序列發(fā)生切割，但如果緩沖液中甘油濃度超過5%，其識別位點發(fā)生松動，可在AATT處發(fā)生切割，EcoRⅠ這種特殊的識別能力叫做星活性，用EcoRⅠ*表示。星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。影響因素：甘油濃度12-20%，酶與DNA比例，離子強度，45%聚乙二醇(PEG)，有機溶劑，8%二甲基亞楓，二價陽離子，12%乙醇。7.限制性核酸內(nèi)切酶的應用重組DNA前的切割構(gòu)建新質(zhì)粒構(gòu)建物理圖譜DNA分子雜交用限制性內(nèi)切酶消化受體DNA制備DNA探針亞克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究利用限制酶對DNA進行消化的具體步驟：不同的限制酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應條件，甚至對同一種酶也如此，所以建議遵循與酶一起提供的說明書進行操作。以下是對0.2-1.0μgDNA進行消化的典型反應步驟，如要對更大量的DNA進行消化，則反應的各個成分須相應放大?？偨Y(jié)1)加入合適體積的DNA溶液；2)加入2μl適當?shù)?0X限制酶消化緩沖液，輕敲管外壁以混勻3)加入1－2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之；4)將上述混合反應物置于適當溫度并按所需的時間進行溫育；5)加入0.5MEDTA（pH8.0）使終濃度達10mM，以終止反應；6)如果消化后DNA直接進行凝膠電泳分析，可加入6μl凝膠電泳加樣緩沖液混合后，再加樣進行電泳。

如欲純化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。酶切反應注意事項價格昂貴決不能用水稀釋,以免變性失活。預先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會抑制酶活性。Ⅱ類R-M系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。大多數(shù)限制酶都已分離出相應的甲基化酶。甲基化酶也稱修飾酶(modificationenzyme)，用來修飾限制酶的識別序列，在該序列位點的胞嘧啶（C）5-氨基上加一個甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識別而免于切割。2.甲基化酶(methylase)甲基化酶分兩類：維持性甲基化酶：用于在新合成的DNA鏈上進行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA鏈上進行甲基化的酶。用甲基化酶進行甲基化的作用封閉DNA鏈中的某些識別位點，保護多余的限制性酶切位點。構(gòu)建新的酶切位點3DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵T4DNA連接酶可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈

DNA分子相互連接。大腸桿菌DNA連接酶只能連接帶匹配粘末端的DNA分子AATTC······GG······CTTAA5′5′(a)分子間連接(b)分子內(nèi)連接ATGCTATAGCTAT4連接酶AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′5′5′(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5′5′(1)(2)T4連接酶連接酶反應溫度12-16℃4DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指導下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。DNA聚合酶在DNA復制時起關鍵作用。DNA聚合酶主要有三類：聚合酶Ⅰ（polⅠ）：參與DNA修復，是基因工程中的常用酶聚合酶Ⅱ(polⅡ)聚合酶Ⅲ(polⅢ)：聚合酶Ⅲ參與DNA復制。1）5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2）5′→3′外切酶活性

3）3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶的三種活性DNApolⅠ的5‘→3’聚合活性和5‘→3’外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5‘→3’方向移動，這種反應叫做缺口平移(nicktranslation)。利用此反應可在體外對DNA片段進行放射性磷(α-32PdNTP)的標記制成探針(probe)，進行核酸的分子雜交實驗，是現(xiàn)代分子生物學的一項重要技術(shù)(見下圖)。DNA聚合酶Ⅰ在DNA復制過程中的作用DNA聚合酶Ⅰ缺口平移作用DNA雜交探針的制備5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’*5‘3’3‘5’*******(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3’-OH末端的單鏈缺口(c)polⅠ從5‘-P移去一個核苷酸(d)polⅠ將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(c)(d)的步驟，缺口沿5’-3‘方向移動，形成32P標記的核苷酸合成的DNA鏈探針（probe）探針：用來探知被測物存在的小DNA或RNA叫做探針。標記物：探針上結(jié)合有易被檢測的化合物稱為標記物。分子雜交：探針DNA或RNA與被測物的互補結(jié)合叫做分子雜交（molecularhybridization）主要的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)T4DNA聚合酶

(T4Phage感染的E.coli）T7DNA聚合酶

(T7Phage感染的E.coli)修飾的T7DNA聚合酶

(測序酶)TaqDNA聚合酶

(耐熱)DNA末端轉(zhuǎn)移酶

(不依賴DNA)反轉(zhuǎn)錄酶

(依賴RNA聚合酶)DNA聚合酶Ⅰ來源

E.coli，由染色體DNA基因編碼。商品上用的此酶來源于PhageNM964整合的溶源性E.coli。結(jié)構(gòu)一條多肽鏈，MW=109，000D活性

5′→3′聚合，3′→5′和5′→3′外切Klenow來源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ經(jīng)蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970)DNApolⅠ枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶C端(76kd)+N端（36kd）5’→3’外切Klenow5’→3’聚合3’→5’外切Klenow用途填補限制酶的5′-粘性末端為平齊末端5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’3’…GGAATT5’Klenow3′-末端標記：Klenow

在無底物時只進行3′→5′外切；有底物存在時則聚合。這種標記也稱作交換標記，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶來源：T4Phage感染的E.coli結(jié)構(gòu)：MW=114，000D活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，對單鏈活性大于雙鏈DNA，外切酶活性比Klenow大200倍用途填補或標記限制酶切后產(chǎn)生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同Klenow）3′-粘性末端的標記制備DNA探針,同Klenow末端標記。

T7DNA聚合酶（測序酶）來源：T7Phage感染的E.coli結(jié)構(gòu)：由2個蛋白亞基組成：

T7phagegene5蛋白

+宿主硫氧蛋白活性：5′→3′聚合，持續(xù)反應時間最長，所以合成的DNA鏈長。故在DNA測序中很優(yōu)越。3′→5′外切，是DNA聚合酶Ⅰ的1000倍。用途復制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列用填補或交換反應快速進行末端標記。與T４DNApol一樣，平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。5′3′3′5′修飾的T7DNA聚合酶(測序酶)來源：天然T7DNA聚合酶經(jīng)修飾處理結(jié)構(gòu)：同T7聚合酶。用還原劑、分子氧、低濃度Fe２+與酶保溫幾天，可使PhageT7gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中心失活(O-修飾)。即：5′→3′聚合酶作用提高，持續(xù)性長。3′→5′外切作用下降99%以上。TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)來源：從耐熱細胞中純化，已有基因工程酶多種結(jié)構(gòu)：單亞基MW=94000d?；钚裕壕酆献钸m溫度為75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性。用途：PCR反應。測序，高溫下進行DNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。末端轉(zhuǎn)移酶(不依賴模板的DNA聚合酶)來源：只在前淋巴細胞和淋巴細胞分化早期階段中存在的罕見的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。結(jié)構(gòu)：MW=60，000d.活性：催化dNTP摻入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端；反應不需模板DNA，需Co2+用途：克隆DNA片段時加上互補同聚物末端，便于與載體連接。末端標記反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

來源：商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種來自禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)。來自能表達Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的E.coli。結(jié)構(gòu)和活性：酶類別肽鏈5’-3’聚合活性RNaseHAMVα62，000β94，000++++M-MLV84，000++用途：(1)5’3’聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子；(2)RNA酶H活性，對RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板的步驟。(3)用于３’凹陷末端的標記，雜交探針的制備和DNA序列測定．

cDNA的合成主要步驟：在某種生物的mRNA分子中，加入引物使之與mRNA退火，并引導逆轉(zhuǎn)錄酶按照mRNA模板合成第一鏈cDNA，產(chǎn)物是mRNA:DNA雜交分子；然后再以cDNA第一鏈為模板合成cDNA．來源T7、T3RNA聚合酶在E.coli

（或細菌）中的克隆表達。E.coli

RNA聚合酶?；钚裕涸贒NA指導下合成RNA，結(jié)合于啟動子部位，轉(zhuǎn)錄無意義鏈(一)產(chǎn)生與有意義鏈相似(以U代替模板中T)的鏈。

轉(zhuǎn)錄鏈為無意義鏈，負鏈(-)。不轉(zhuǎn)錄鏈為有意義鏈，正鏈(+)。5RNA聚合酶（RNApolymerase）磷酸激酶催化5’-OH加P（標記）和磷酸酶去除5’-P（防止自身環(huán)化）PNKasePMase

5′HOATTAGC………CCGTAATCG………GG