流感病毒的感染與防治

流感病毒的感染與防治

感染帶是流感病毒引起的急性呼吸道疾病。在歷史上,曾發(fā)生過多次世界范圍的流感大流行,其中以1918年的流感流行最為嚴重,其死亡人數達到2000多萬,且死亡者多數為15～45歲的青壯年。目前,流感的威脅依然存在,據統(tǒng)計,全世界平均每年有50～100萬人死于流感。WHO早在1948年就已啟動了流感計劃,并已經在全世界83個國家建立了111個國家研究中心和4個協作中心,對流感病毒進行樣本收集、檢測和研究。盡管如此,科學家們仍然希望用5年時間投入4500萬美元建立一個全球實驗室來研究流感。由此可見,流感作為一種病毒性傳染病不僅嚴重威脅著公眾健康,而且給國家和社會帶來了沉重的經濟負擔。流感病毒屬于正粘病毒科。根據病毒核蛋白(NP)和基質蛋白抗原性的差異,可分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型3種;又根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性將其分成不同的亞型(HxNy)。從流感流行的歷史資料分析,乙型和丙型流感病毒抗原性比較穩(wěn)定;甲型流感病毒的表面抗原HA和NA則較易發(fā)生變異。目前,在人群中流行的流感病毒亞型為H1N1和H3N2。由于流感病毒的抗原變異能力強,加之個體免疫力的不同,疫苗的保護率并不高,況且,疫苗只對已知的流感病毒亞型有預防作用,而對于由抗原性漂移或抗原性轉換所產生的新型流感病毒無效。因此,抗流感病毒藥物研究顯得更加重要和緊迫。1金剛烷胺和na抑制劑目前,正式上市的抗流感藥物大體分為兩類:(1)以20世紀60年代中期發(fā)現的金剛烷胺(amantadine)為代表,只對甲型流感病毒有預防和治療作用,屬于離子通道阻斷劑;(2)NA抑制劑,對甲型和乙型流感病毒均有效。另外,以流感病毒復制過程的不同環(huán)節(jié)為靶點,還有一些藥物正處于實驗室研究或臨床試驗階段。1.1基質蛋白-2和金剛烷胺此類藥物以流感病毒基質蛋白-2為作用靶點,通過阻斷H+通道來抑制流感病毒復制,所以被稱為離子通道阻斷劑,包括金剛烷胺和金剛乙胺(rimantadine)?；|蛋白-2是流感病毒包膜上的一個跨膜蛋白,具有H+通道活性。它是一個由97個氨基酸殘基組成的同源四聚體,其結構分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內區(qū)3部分。其中跨膜區(qū)由4個幾乎完全一致的α螺旋組成H+通道,病毒包膜低電解質環(huán)境迫使α螺旋間的氫鍵具有相同的幾何構象,從而最大限度地降低了親水肽鏈在膜外的暴露。特定的條件使得基質蛋白-2被充分地限制在病毒包膜中,同時保持了良好的結構和功能。實驗證明,流感病毒基質蛋白-2在病毒脫衣殼和成熟過程中起重要作用。在流感病毒感染細胞早期,病毒吸附到細胞表面含唾液酸的糖蛋白受體上,通過受體介導的內吞作用進入細胞,形成核內體(endosome)。此時,基質蛋白-2被激活并打開,H+進入病毒內使pH降低,核內體的酸化引起HA構象變化,介導病毒包膜與核內體膜融合。同時,病毒顆粒內也發(fā)生酸化,導致病毒核衣殼與基質蛋白-1之間解離,為病毒基因組進入感染細胞核提供了必要條件。在病毒感染細胞晚期,基質蛋白-2的H+通道活性可以升高高爾基復合體內的H+濃度,使流感病毒膜蛋白HA形成高pH構象,從而使新生的病毒具有感染性。離子通道阻斷劑金剛烷胺(1966年上市)及其衍生物金剛乙胺(1987年上市)有抗流感病毒作用。實驗發(fā)現,金剛烷胺能夠與質子競爭結合基質蛋白-2,結合部位在距離脂質雙層膜中心0.5nm處的Val27和Ser31中間的特定區(qū)域內,從而影響基質蛋白-2的活性,阻斷H+通道的作用,抑制流感病毒的復制,發(fā)揮預防和治療作用。從正式獲準上市至今,金剛烷胺和金剛乙胺已在臨床應用多年。最近,Jefferson等通過多種渠道對這些臨床應用的數據和資料進行了系統(tǒng)的收集、整理和統(tǒng)計,并對這兩種藥物的有效性和安全性進行了評價。結果表明,金剛烷胺對流感樣疾病(influenza-likeillness,ILI)和甲型流感的保護率分別為25%和61%,并且能夠使發(fā)熱持續(xù)時間減少1d。金剛乙胺有相似的療效,但其預防作用與安慰劑或其他方法相比并無顯著性差異。同時,研究結果顯示,金剛烷胺和金剛乙胺均可引起明顯的胃腸道不良反應;金剛烷胺與金剛乙胺相比,產生中樞神經毒副作用和學習能力減退更為常見。另外,此類藥物容易產生耐藥和交叉耐藥,這與基質蛋白-2基因序列中單個核苷酸發(fā)生突變有關。臨床試驗表明,應用金剛烷胺后基質蛋白-2跨膜區(qū)中的四個氨基酸位點26,27,30和31最易產生突變。并且,不同病毒亞型突變位點與頻率不同:H3N2亞型常在31位發(fā)生突變(絲氨酸→天冬酰胺),而H1N1亞型則在27位發(fā)生突變(纈氨酸→丙氨酸);前者的突變頻率高于后者。最近,Astrahan等發(fā)現,流感病毒可以通過增大離子通道口徑的辦法,使藥物雖然能夠與基質蛋白-2結合卻不能完全封閉離子轉運,從而產生耐藥性。1.2dna抑制劑的應用NA是流感病毒包膜上重要的糖蛋白,由4個亞基組成四聚體。主要結構包括胞漿尾部、跨膜區(qū)、桿部和球狀頭部4部分。其中頭部具有水解酶活性,可水解感染細胞表面糖蛋白末端的神經氨酸與相鄰糖基的α-糖苷鍵,切除病毒表面和感染細胞表面的唾液酸,一方面破壞了細胞膜上的病毒特異性受體,使病毒從感染細胞膜上釋放;另一方面,可以防止新生病毒的自身凝集,允許病毒擴散并增強其感染能力。此外,NA還可促進病毒從呼吸道粘液向周圍組織擴散。NA在流感病毒復制和傳播中發(fā)揮重要作用,并且其活性中心的氨基酸組成高度保守,因此,以NA為靶點開發(fā)選擇性抑制劑具有非常重要的意義。最初設計的Neu5Ac2en是神經氨酸的脫水衍生物,它從分子構象上模擬了NA催化反應過程中的作用物過渡態(tài),因此,可以與NA結合并抑制其酶活性。后來,為了增強Neu5Ac2en和酶活性中心的相互作用,研究人員對Neu5Ac2en的結構進行了改造:(1)以胍基取代4位碳原子上的羥基,得到扎那米韋(zanamivir,GG167,Relenza);(2)應用一個環(huán)己烷及用親脂性側鏈取代極性丙三醇,得到奧塞米韋(oseltamivir,GS4104,Tamiflu)。目前,扎那米韋和奧塞米韋是在美國僅有的獲準上市的NA抑制劑。另外,帶有一個胍基基團和親脂性側鏈的環(huán)戊烷衍生物RWJ-270201(BCX-1812)正處于Ⅱ期臨床試驗階段。研究發(fā)現,它對于對扎那米韋和奧塞米韋已產生耐藥性的甲型和乙型流感病毒變異體有抑制作用,有望成為第三個獲準上市的NA抑制劑。NA抑制劑對甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。它們能夠與病毒的NA特異性結合,阻斷該酶的活性,使病毒不能輕易地從感染細胞表面釋放,促進病毒凝集,阻止病毒進一步擴散,從而發(fā)揮抗流感作用。扎那米韋和奧塞米韋已經在臨床應用中顯示了良好的治療作用。最近的一些臨床試驗結果表明,與安慰劑相比,扎那米韋和奧塞米韋可以顯著地減少流感急性癥狀的持續(xù)時間1～2.5d(依不同亞型而異),使并發(fā)癥發(fā)生率降低50%～70%,使患者提前1～3d恢復正?；顒幽芰?。并且,多數試驗顯示,發(fā)病后越早給藥,治療效果越明顯。與離子通道阻斷劑相類似,由于NA抑制劑在人群中的廣泛應用,使得流感病毒產生了一定程度的耐藥性。體外實驗結果表明,NA和HA均能影響病毒對此類藥物的易感性。病毒NA主要通過其活性位點中單個氨基酸殘基的改變產生耐藥性,而HA則通過其受體結合位點處氨基酸的組成、寡糖鏈的位置和數量等因素的改變來影響病毒的易感性。由于病毒耐藥機制的復雜性和實驗條件的限制,對于這方面的研究還有待深入。1.3ha1和ha2對病毒和感染細胞外體膜的激活作用HA是位于流感病毒表面的一個重要糖蛋白,在轉錄后首先表達為無活性的前體HA0,然后經過蛋白酶催化水解為兩個有活性的多肽亞單位HA1和HA2。實驗證實,HA1介導病毒與感染細胞受體上唾液酸之間的吸附作用;HA2引導病毒包膜和核內體膜的融合。目前,以HA1和HA2為靶點,已經發(fā)現了一些有抗流感病毒活性的化合物。1.3.1價和多價類似物已知流感病毒HA1鏈遠端球狀頭部上的抗原表位可以識別和多價結合細胞表面受體上的唾液酸,介導病毒的吸附。唾液酸類似物可以誘使HA1鏈上的受體結合位點與之結合,從而干擾或阻斷病毒的吸附作用。研究表明,單價的唾液酸類似物不能有效地與靶細胞上的多價受體競爭結合流感病毒,因此,為了提高抗病毒作用,研究人員通過多種方法設計合成了二價和多價唾液酸類似物(包括唾液酸糖苷脂質體、唾液酸糖苷多聚物和樹突狀唾液酸類似物)。Reuter等對多價唾液酸類似物的研究表明,結構和形狀對此類藥物的作用效果有明顯影響。他們對線形、球形和樹突狀等幾種不同形狀的多聚物分別進行了抗流感病毒的體外實驗,結果顯示,樹突狀唾液酸類似物的作用效果最佳,并且,在治療水平無細胞毒作用。1.3.2膜融合抑制劑的應用流感病毒與核內體膜發(fā)生融合是病毒基因組進入細胞并進行復制的關鍵步驟。研究表明,流感病毒HA2鏈在核內體pH降至5左右時發(fā)生構象變化,N端的融合肽暴露并插入核內體膜中,引導兩者的膜融合。目前文獻報道的流感病毒膜融合抑制劑多數是通過抑制低pH誘導的HA構象變化發(fā)揮抗病毒作用,其中代表性藥物是Stachyflin。體外實驗證實,此化合物能夠穩(wěn)定HA在中性pH條件下的構象。另外,Stachy-flin只對流感病毒H1和H2兩個亞型有效,而對H3和B型流感病毒無抑制作用,具有亞型特異性。1.4s-ocd對pb1和pb2表達的抑制作用反義寡核苷酸(ODN)作為一種研究工具,已經被廣泛應用于特異性抑制基因表達,并作為潛在的治療藥物在艾滋病、癌癥、流感、單純皰疹及其他疾病的研究中占有重要地位。在應用ODN對流感病毒基因組中的四個不同基因PB1,PB2,PA和NP進行抑制的研究中發(fā)現:(1)脂質體包裹的硫代磷酸酯類反義寡核苷酸(S-ODN)對PB2的起始密碼子AUG有較高的抑制作用,而對PB1的抑制作用相對較弱;(2)脂質體包裹的S-ODN比自由寡核苷酸顯示了更高的抑制活性和序列特異性。另外,研究人員還將針對流感病毒PB2-AUG和PA-AUG的兩種S-ODN靜脈注射給甲型流感病毒感染的小鼠,結果顯示,針對流感病毒PB2-AUG的一段寡核苷酸顯著地延長了小鼠的平均存活時間,提高了存活率,并具有劑量依賴性。這是第一次在體內實驗中應用ODN治療流感獲得成功,為ODN在流感治療中的應用帶來了新的希望。1.5以pa和病毒為靶點的部分蛋白RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導的序列特異性轉錄后基因沉默現象,并且是一種在進化上高度保守的免疫防御機制。RNAi作為抑制流感病毒感染的理想方法主要有以下幾個原因:(1)流感病毒為RNA病毒,在病毒的整個生命周期中除mRNA外,病毒顆粒RNA(virionRNA)和互補RNA(complementaryRNA)均可以作為小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)作用的靶點;(2)由于流感病毒基因組分片段編碼不同的病毒蛋白,每一種蛋白在病毒的生命周期中都發(fā)揮重要作用,因此,可以同時抑制一個或多個病毒基因片段,從而更好地防止耐藥病毒的產生;(3)siRNA可以通過吸入的方式給藥,不僅使用方便,而且可以增加其在感染部位的藥物濃度。并且,由于感染早期病毒數量小,充足的siRNA可以更為有效地抑制病毒的復制,從而起到預防和治療的效果;④RNAi與流感疫苗不同,不需要使用者具有健全的免疫系統(tǒng),因此,對于年老或免疫缺陷病人也可使用。基于上述認識,Ge等針對流感病毒的不同基因設計了20個siRNA,結果提示以NP和PA基因為靶點的siRNA對流感病毒感染有抑制作用。另外,Bertrand等的研究表明,與ODN相比,siRNA的抗流感病毒作用更為有效和持久。2抗流感病毒的藥物流感作為嚴重危害公眾健康的病毒性傳染病,始終伴隨著人們的生活。雖然已知的流感病毒已經得到控制,但是,由于流感病毒的抗原變異能力極強且相當頻繁,疫苗的研制和生產相對滯后,對于易感人群的保護率不高,因此,新的流感大流行隨時都有可能爆發(fā)。在這種情況下,尋找具有預防和治療作用的抗流感藥物就顯得尤為重要和緊迫。目前,抗流感病毒的藥物研究已取得初步成果,已有離子通道阻斷劑和NA抑制劑兩大類四種藥物在國外正式上市,某些藥物正處于臨床試驗階段,有望在未來幾年內獲準在臨床上使用。但是,由于現有藥物在臨床上的廣泛應用,使得流感病毒