流感病毒的感染與防治

流感病毒的感染與防治

感染帶是流感病毒引起的急性呼吸道疾病。在歷史上,曾發(fā)生過多次世界范圍的流感大流行,其中以1918年的流感流行最為嚴(yán)重,其死亡人數(shù)達(dá)到2000多萬,且死亡者多數(shù)為15～45歲的青壯年。目前,流感的威脅依然存在,據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界平均每年有50～100萬人死于流感。WHO早在1948年就已啟動(dòng)了流感計(jì)劃,并已經(jīng)在全世界83個(gè)國(guó)家建立了111個(gè)國(guó)家研究中心和4個(gè)協(xié)作中心,對(duì)流感病毒進(jìn)行樣本收集、檢測(cè)和研究。盡管如此,科學(xué)家們?nèi)匀幌Ｍ?年時(shí)間投入4500萬美元建立一個(gè)全球?qū)嶒?yàn)室來研究流感。由此可見,流感作為一種病毒性傳染病不僅嚴(yán)重威脅著公眾健康,而且給國(guó)家和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。流感病毒屬于正粘病毒科。根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白抗原性的差異,可分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型3種;又根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性將其分成不同的亞型(HxNy)。從流感流行的歷史資料分析,乙型和丙型流感病毒抗原性比較穩(wěn)定;甲型流感病毒的表面抗原HA和NA則較易發(fā)生變異。目前,在人群中流行的流感病毒亞型為H1N1和H3N2。由于流感病毒的抗原變異能力強(qiáng),加之個(gè)體免疫力的不同,疫苗的保護(hù)率并不高,況且,疫苗只對(duì)已知的流感病毒亞型有預(yù)防作用,而對(duì)于由抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)換所產(chǎn)生的新型流感病毒無效。因此,抗流感病毒藥物研究顯得更加重要和緊迫。1金剛烷胺和na抑制劑目前,正式上市的抗流感藥物大體分為兩類:(1)以20世紀(jì)60年代中期發(fā)現(xiàn)的金剛烷胺(amantadine)為代表,只對(duì)甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用,屬于離子通道阻斷劑;(2)NA抑制劑,對(duì)甲型和乙型流感病毒均有效。另外,以流感病毒復(fù)制過程的不同環(huán)節(jié)為靶點(diǎn),還有一些藥物正處于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床試驗(yàn)階段。1.1基質(zhì)蛋白-2和金剛烷胺此類藥物以流感病毒基質(zhì)蛋白-2為作用靶點(diǎn),通過阻斷H+通道來抑制流感病毒復(fù)制,所以被稱為離子通道阻斷劑,包括金剛烷胺和金剛乙胺(rimantadine)?；|(zhì)蛋白-2是流感病毒包膜上的一個(gè)跨膜蛋白,具有H+通道活性。它是一個(gè)由97個(gè)氨基酸殘基組成的同源四聚體,其結(jié)構(gòu)分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)3部分。其中跨膜區(qū)由4個(gè)幾乎完全一致的α螺旋組成H+通道,病毒包膜低電解質(zhì)環(huán)境迫使α螺旋間的氫鍵具有相同的幾何構(gòu)象,從而最大限度地降低了親水肽鏈在膜外的暴露。特定的條件使得基質(zhì)蛋白-2被充分地限制在病毒包膜中,同時(shí)保持了良好的結(jié)構(gòu)和功能。實(shí)驗(yàn)證明,流感病毒基質(zhì)蛋白-2在病毒脫衣殼和成熟過程中起重要作用。在流感病毒感染細(xì)胞早期,病毒吸附到細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白受體上,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,形成核內(nèi)體(endosome)。此時(shí),基質(zhì)蛋白-2被激活并打開,H+進(jìn)入病毒內(nèi)使pH降低,核內(nèi)體的酸化引起HA構(gòu)象變化,介導(dǎo)病毒包膜與核內(nèi)體膜融合。同時(shí),病毒顆粒內(nèi)也發(fā)生酸化,導(dǎo)致病毒核衣殼與基質(zhì)蛋白-1之間解離,為病毒基因組進(jìn)入感染細(xì)胞核提供了必要條件。在病毒感染細(xì)胞晚期,基質(zhì)蛋白-2的H+通道活性可以升高高爾基復(fù)合體內(nèi)的H+濃度,使流感病毒膜蛋白HA形成高pH構(gòu)象,從而使新生的病毒具有感染性。離子通道阻斷劑金剛烷胺(1966年上市)及其衍生物金剛乙胺(1987年上市)有抗流感病毒作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),金剛烷胺能夠與質(zhì)子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合基質(zhì)蛋白-2,結(jié)合部位在距離脂質(zhì)雙層膜中心0.5nm處的Val27和Ser31中間的特定區(qū)域內(nèi),從而影響基質(zhì)蛋白-2的活性,阻斷H+通道的作用,抑制流感病毒的復(fù)制,發(fā)揮預(yù)防和治療作用。從正式獲準(zhǔn)上市至今,金剛烷胺和金剛乙胺已在臨床應(yīng)用多年。最近,Jefferson等通過多種渠道對(duì)這些臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)和資料進(jìn)行了系統(tǒng)的收集、整理和統(tǒng)計(jì),并對(duì)這兩種藥物的有效性和安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,金剛烷胺對(duì)流感樣疾病(influenza-likeillness,ILI)和甲型流感的保護(hù)率分別為25%和61%,并且能夠使發(fā)熱持續(xù)時(shí)間減少1d。金剛乙胺有相似的療效,但其預(yù)防作用與安慰劑或其他方法相比并無顯著性差異。同時(shí),研究結(jié)果顯示,金剛烷胺和金剛乙胺均可引起明顯的胃腸道不良反應(yīng);金剛烷胺與金剛乙胺相比,產(chǎn)生中樞神經(jīng)毒副作用和學(xué)習(xí)能力減退更為常見。另外,此類藥物容易產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥,這與基質(zhì)蛋白-2基因序列中單個(gè)核苷酸發(fā)生突變有關(guān)。臨床試驗(yàn)表明,應(yīng)用金剛烷胺后基質(zhì)蛋白-2跨膜區(qū)中的四個(gè)氨基酸位點(diǎn)26,27,30和31最易產(chǎn)生突變。并且,不同病毒亞型突變位點(diǎn)與頻率不同:H3N2亞型常在31位發(fā)生突變(絲氨酸→天冬酰胺),而H1N1亞型則在27位發(fā)生突變(纈氨酸→丙氨酸);前者的突變頻率高于后者。最近,Astrahan等發(fā)現(xiàn),流感病毒可以通過增大離子通道口徑的辦法,使藥物雖然能夠與基質(zhì)蛋白-2結(jié)合卻不能完全封閉離子轉(zhuǎn)運(yùn),從而產(chǎn)生耐藥性。1.2dna抑制劑的應(yīng)用NA是流感病毒包膜上重要的糖蛋白,由4個(gè)亞基組成四聚體。主要結(jié)構(gòu)包括胞漿尾部、跨膜區(qū)、桿部和球狀頭部4部分。其中頭部具有水解酶活性,可水解感染細(xì)胞表面糖蛋白末端的神經(jīng)氨酸與相鄰糖基的α-糖苷鍵,切除病毒表面和感染細(xì)胞表面的唾液酸,一方面破壞了細(xì)胞膜上的病毒特異性受體,使病毒從感染細(xì)胞膜上釋放;另一方面,可以防止新生病毒的自身凝集,允許病毒擴(kuò)散并增強(qiáng)其感染能力。此外,NA還可促進(jìn)病毒從呼吸道粘液向周圍組織擴(kuò)散。NA在流感病毒復(fù)制和傳播中發(fā)揮重要作用,并且其活性中心的氨基酸組成高度保守,因此,以NA為靶點(diǎn)開發(fā)選擇性抑制劑具有非常重要的意義。最初設(shè)計(jì)的Neu5Ac2en是神經(jīng)氨酸的脫水衍生物,它從分子構(gòu)象上模擬了NA催化反應(yīng)過程中的作用物過渡態(tài),因此,可以與NA結(jié)合并抑制其酶活性。后來,為了增強(qiáng)Neu5Ac2en和酶活性中心的相互作用,研究人員對(duì)Neu5Ac2en的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造:(1)以胍基取代4位碳原子上的羥基,得到扎那米韋(zanamivir,GG167,Relenza);(2)應(yīng)用一個(gè)環(huán)己烷及用親脂性側(cè)鏈取代極性丙三醇,得到奧塞米韋(oseltamivir,GS4104,Tamiflu)。目前,扎那米韋和奧塞米韋是在美國(guó)僅有的獲準(zhǔn)上市的NA抑制劑。另外,帶有一個(gè)胍基基團(tuán)和親脂性側(cè)鏈的環(huán)戊烷衍生物RWJ-270201(BCX-1812)正處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。研究發(fā)現(xiàn),它對(duì)于對(duì)扎那米韋和奧塞米韋已產(chǎn)生耐藥性的甲型和乙型流感病毒變異體有抑制作用,有望成為第三個(gè)獲準(zhǔn)上市的NA抑制劑。NA抑制劑對(duì)甲型和乙型流感病毒均有抑制作用。它們能夠與病毒的NA特異性結(jié)合,阻斷該酶的活性,使病毒不能輕易地從感染細(xì)胞表面釋放,促進(jìn)病毒凝集,阻止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散,從而發(fā)揮抗流感作用。扎那米韋和奧塞米韋已經(jīng)在臨床應(yīng)用中顯示了良好的治療作用。最近的一些臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,與安慰劑相比,扎那米韋和奧塞米韋可以顯著地減少流感急性癥狀的持續(xù)時(shí)間1～2.5d(依不同亞型而異),使并發(fā)癥發(fā)生率降低50%～70%,使患者提前1～3d恢復(fù)正?；顒?dòng)能力。并且,多數(shù)試驗(yàn)顯示,發(fā)病后越早給藥,治療效果越明顯。與離子通道阻斷劑相類似,由于NA抑制劑在人群中的廣泛應(yīng)用,使得流感病毒產(chǎn)生了一定程度的耐藥性。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NA和HA均能影響病毒對(duì)此類藥物的易感性。病毒NA主要通過其活性位點(diǎn)中單個(gè)氨基酸殘基的改變產(chǎn)生耐藥性,而HA則通過其受體結(jié)合位點(diǎn)處氨基酸的組成、寡糖鏈的位置和數(shù)量等因素的改變來影響病毒的易感性。由于病毒耐藥機(jī)制的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)條件的限制,對(duì)于這方面的研究還有待深入。1.3ha1和ha2對(duì)病毒和感染細(xì)胞外體膜的激活作用HA是位于流感病毒表面的一個(gè)重要糖蛋白,在轉(zhuǎn)錄后首先表達(dá)為無活性的前體HA0,然后經(jīng)過蛋白酶催化水解為兩個(gè)有活性的多肽亞單位HA1和HA2。實(shí)驗(yàn)證實(shí),HA1介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞受體上唾液酸之間的吸附作用;HA2引導(dǎo)病毒包膜和核內(nèi)體膜的融合。目前,以HA1和HA2為靶點(diǎn),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些有抗流感病毒活性的化合物。1.3.1價(jià)和多價(jià)類似物已知流感病毒HA1鏈遠(yuǎn)端球狀頭部上的抗原表位可以識(shí)別和多價(jià)結(jié)合細(xì)胞表面受體上的唾液酸,介導(dǎo)病毒的吸附。唾液酸類似物可以誘使HA1鏈上的受體結(jié)合位點(diǎn)與之結(jié)合,從而干擾或阻斷病毒的吸附作用。研究表明,單價(jià)的唾液酸類似物不能有效地與靶細(xì)胞上的多價(jià)受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合流感病毒,因此,為了提高抗病毒作用,研究人員通過多種方法設(shè)計(jì)合成了二價(jià)和多價(jià)唾液酸類似物(包括唾液酸糖苷脂質(zhì)體、唾液酸糖苷多聚物和樹突狀唾液酸類似物)。Reuter等對(duì)多價(jià)唾液酸類似物的研究表明,結(jié)構(gòu)和形狀對(duì)此類藥物的作用效果有明顯影響。他們對(duì)線形、球形和樹突狀等幾種不同形狀的多聚物分別進(jìn)行了抗流感病毒的體外實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,樹突狀唾液酸類似物的作用效果最佳,并且,在治療水平無細(xì)胞毒作用。1.3.2膜融合抑制劑的應(yīng)用流感病毒與核內(nèi)體膜發(fā)生融合是病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的關(guān)鍵步驟。研究表明,流感病毒HA2鏈在核內(nèi)體pH降至5左右時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化,N端的融合肽暴露并插入核內(nèi)體膜中,引導(dǎo)兩者的膜融合。目前文獻(xiàn)報(bào)道的流感病毒膜融合抑制劑多數(shù)是通過抑制低pH誘導(dǎo)的HA構(gòu)象變化發(fā)揮抗病毒作用,其中代表性藥物是Stachyflin。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),此化合物能夠穩(wěn)定HA在中性pH條件下的構(gòu)象。另外,Stachy-flin只對(duì)流感病毒H1和H2兩個(gè)亞型有效,而對(duì)H3和B型流感病毒無抑制作用,具有亞型特異性。1.4s-ocd對(duì)pb1和pb2表達(dá)的抑制作用反義寡核苷酸(ODN)作為一種研究工具,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于特異性抑制基因表達(dá),并作為潛在的治療藥物在艾滋病、癌癥、流感、單純皰疹及其他疾病的研究中占有重要地位。在應(yīng)用ODN對(duì)流感病毒基因組中的四個(gè)不同基因PB1,PB2,PA和NP進(jìn)行抑制的研究中發(fā)現(xiàn):(1)脂質(zhì)體包裹的硫代磷酸酯類反義寡核苷酸(S-ODN)對(duì)PB2的起始密碼子AUG有較高的抑制作用,而對(duì)PB1的抑制作用相對(duì)較弱;(2)脂質(zhì)體包裹的S-ODN比自由寡核苷酸顯示了更高的抑制活性和序列特異性。另外,研究人員還將針對(duì)流感病毒PB2-AUG和PA-AUG的兩種S-ODN靜脈注射給甲型流感病毒感染的小鼠,結(jié)果顯示,針對(duì)流感病毒PB2-AUG的一段寡核苷酸顯著地延長(zhǎng)了小鼠的平均存活時(shí)間,提高了存活率,并具有劑量依賴性。這是第一次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ODN治療流感獲得成功,為ODN在流感治療中的應(yīng)用帶來了新的希望。1.5以pa和病毒為靶點(diǎn)的部分蛋白R(shí)NA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,并且是一種在進(jìn)化上高度保守的免疫防御機(jī)制。RNAi作為抑制流感病毒感染的理想方法主要有以下幾個(gè)原因:(1)流感病毒為RNA病毒,在病毒的整個(gè)生命周期中除mRNA外,病毒顆粒RNA(virionRNA)和互補(bǔ)RNA(complementaryRNA)均可以作為小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)作用的靶點(diǎn);(2)由于流感病毒基因組分片段編碼不同的病毒蛋白,每一種蛋白在病毒的生命周期中都發(fā)揮重要作用,因此,可以同時(shí)抑制一個(gè)或多個(gè)病毒基因片段,從而更好地防止耐藥病毒的產(chǎn)生;(3)siRNA可以通過吸入的方式給藥,不僅使用方便,而且可以增加其在感染部位的藥物濃度。并且,由于感染早期病毒數(shù)量小,充足的siRNA可以更為有效地抑制病毒的復(fù)制,從而起到預(yù)防和治療的效果;④RNAi與流感疫苗不同,不需要使用者具有健全的免疫系統(tǒng),因此,對(duì)于年老或免疫缺陷病人也可使用?；谏鲜稣J(rèn)識(shí),Ge等針對(duì)流感病毒的不同基因設(shè)計(jì)了20個(gè)siRNA,結(jié)果提示以NP和PA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA對(duì)流感病毒感染有抑制作用。另外,Bertrand等的研究表明,與ODN相比,siRNA的抗流感病毒作用更為有效和持久。2抗流感病毒的藥物流感作為嚴(yán)重危害公眾健康的病毒性傳染病,始終伴隨著人們的生活。雖然已知的流感病毒已經(jīng)得到控制,但是,由于流感病毒的抗原變異能力極強(qiáng)且相當(dāng)頻繁,疫苗的研制和生產(chǎn)相對(duì)滯后,對(duì)于易感人群的保護(hù)率不高,因此,新的流感大流行隨時(shí)都有可能爆發(fā)。在這種情況下,尋找具有預(yù)防和治療作用的抗流感藥物就顯得尤為重要和緊迫。目前,抗流感病毒的藥物研究已取得初步成果,已有離子通道阻斷劑和NA抑制劑兩大類四種藥物在國(guó)外正式上市,某些藥物正處于臨床試驗(yàn)階段,有望在未來幾年內(nèi)獲準(zhǔn)在臨床上使用。但是,由于現(xiàn)有藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,使得流感病毒