大口黑鱸虹彩病毒病的研究進(jìn)展

大口黑鱸虹彩病毒病的研究進(jìn)展

大口黑魚(yú)（俗稱美國(guó)堅(jiān)果，發(fā)生在北美密歇西比河流域。它是一種無(wú)性系魚(yú)類。它生長(zhǎng)迅速，病蟲(chóng)害少，耐低溫，肉質(zhì)細(xì)膩，易于吞咽。在20世紀(jì)70年代開(kāi)始普及于世界各地。我國(guó)廣東佛山順德地區(qū)是大口黑鱸的主要養(yǎng)殖區(qū)。2008年至2010年初,順德地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖魚(yú)塘大面積暴發(fā)疾病,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)瀕死魚(yú)剖檢發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰾腫大,布滿紅色氣腺。魚(yú)鰾、腎臟研磨除菌后,接種鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞(EpitheliomaofPapulosumcyprini,EPC)分離到致病性大口黑鱸虹彩病毒(Largemouthbassranavirus,暫命名LMBV-C株)。LMBV在大口黑鱸國(guó)內(nèi)主養(yǎng)區(qū)的暴發(fā)引起了我們對(duì)該病的關(guān)注。由于國(guó)內(nèi)對(duì)LMBV的研究報(bào)道較少,為了對(duì)LMBV進(jìn)行深入的了解,并對(duì)該病的研究與防控提供參考,本文將目前國(guó)內(nèi)外已有的關(guān)于LMBV的研究報(bào)道進(jìn)行綜述。1大口黑地震病毒及病毒分類大口黑鱸病毒最早分離自1991年美國(guó)佛羅里達(dá)州LakeWeir市的野生大口黑鱸。1995年美國(guó)南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫(kù)養(yǎng)殖的大口黑鱸暴發(fā)魚(yú)災(zāi)(fishkill)引起人們高度關(guān)注,此后兩三年內(nèi),在美國(guó)阿拉巴馬州、喬治亞州、路易斯安那州、密西西比州和德克薩斯州相繼暴發(fā)不同程度魚(yú)災(zāi),經(jīng)病原分離鑒定為大口黑鱸病毒。1996年,PlumbJA等通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定將大口黑鱸病毒歸類到虹彩病毒科,1999年MaoJ等綜合大口黑鱸病毒蛋白合成分析,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP),主衣殼蛋白(majorcapsidprotein,MCP)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DMet)基因序列分析的結(jié)果,明確了大口黑鱸虹彩病毒的分類地位為虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)成員。MaoJ等還比較了LM-BV、裂唇魚(yú)病毒(Doctorfishvirus,DFV)、孔雀魚(yú)病毒(Guppyfishiridovirus,GV6)、蛙病毒3(Frogvirus3,FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列,以及它們的限制性內(nèi)切酶圖譜,結(jié)果顯示DFV、GV6和LMBV之間同源性高,與蛙病毒代表株FV3有一定差距。因此,MaoJ建議LMBV、DFV和GV6組成蛙病毒屬的新種,在國(guó)際病毒分類委員會(huì)第八次報(bào)告中將LMBV、DFV、GV6歸類為蛙病毒屬的Santee-Cooperranavirus種,該種名也反映了LMBV導(dǎo)致魚(yú)災(zāi)的暴發(fā)地點(diǎn)。2大口黑病病毒病對(duì)美國(guó)的影響目前對(duì)于大口黑鱸病毒的研究報(bào)道仍然是以大口黑鱸原產(chǎn)地美國(guó)為主。自從1995年在美國(guó)南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫(kù)暴發(fā)LMBV導(dǎo)致的魚(yú)災(zāi),此后,美國(guó)東南部又暴發(fā)了幾次大口黑鱸大規(guī)模死亡病例。目前,美國(guó)已經(jīng)報(bào)道發(fā)生大口黑鱸病毒病的州包括阿拉巴馬州、阿肯色州、佛羅里達(dá)州、喬治亞州、伊利諾斯州、印第安納州、肯塔基州、路易斯安那州、密歇根州、密西西比州、密蘇里州、北卡羅萊納州、俄克拉荷馬州、南卡羅萊納州、田納西州、德克薩斯州、維吉尼亞州、佛蒙特州、威斯康星州等。GroocockGH等發(fā)表的研究結(jié)果顯示,其在紐約州37個(gè)地區(qū)收集了283尾野生大口黑鱸和8尾小口黑鱸,采用定量PCR(QPCR)的方法對(duì)來(lái)自13個(gè)地區(qū)的28尾魚(yú)檢測(cè)LMBV顯示陽(yáng)性,證實(shí)美國(guó)紐約州也存在LMBV。大口黑鱸虹彩病毒在其他國(guó)家的暴發(fā)鮮有報(bào)道,鄧國(guó)成等報(bào)道了大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的,這是國(guó)內(nèi)對(duì)大口黑鱸虹彩病毒導(dǎo)致潰瘍病的首次報(bào)道。3水體傳播lmsv一般認(rèn)為健康魚(yú)感染LMBV主要是通過(guò)在水體里接觸病原或者食入帶病魚(yú)餌,人工感染實(shí)驗(yàn)和孵化場(chǎng)還未發(fā)現(xiàn)垂直傳播的病例。由于對(duì)LMBV天然宿主的范圍缺乏系統(tǒng)調(diào)查,其通過(guò)水體傳播病毒的作用仍然不能忽視。ShubhankarN等也已經(jīng)證實(shí),熒光假單胞菌生物膜(biofilm)和池塘混合生物膜包裹的LMBV,保留對(duì)EPC細(xì)胞的感染能力,并對(duì)次氯酸鈉、碘復(fù)合物等消毒劑具有一定抵抗力。除了魚(yú)類,實(shí)驗(yàn)室感染試驗(yàn)證實(shí),LMBV在兩棲類和禽類中可以存活,水陸傳播LMBV也就成為可能。國(guó)外有眾多的垂釣俱樂(lè)部,大口黑鱸是主要的競(jìng)釣品種之一,因此通過(guò)垂釣者和船只傳播病毒也是重要途徑之一。4混合感染的原因LMBV不僅可以導(dǎo)致大面積魚(yú)暴發(fā)疾病死亡引起魚(yú)災(zāi),也可以是不表現(xiàn)任何癥狀的隱性帶毒,這給疾病診斷帶來(lái)困難。對(duì)該病的診斷必須綜合流行情況、癥狀、剖檢、病毒分離鑒定等進(jìn)行判定。該病一般在夏季暴發(fā),30℃的水溫是病毒復(fù)制和人工感染試驗(yàn)的理想溫度。因此,夏季大口黑鱸暴發(fā)不明病因、無(wú)明顯癥狀的大批死亡,首先懷疑是否LMBV感染。自然感染病毒的大口黑鱸,一般浮在水面,大多沒(méi)有肉眼可見(jiàn)典型癥狀,但剖檢可見(jiàn)魚(yú)鰾膨大,布滿紅色氣腺。有時(shí)魚(yú)鰾中有黃色或褐色蠟樣分泌物。在對(duì)該病進(jìn)行臨床診斷時(shí),即使出現(xiàn)上述癥狀,也不能僅僅懷疑是LMBV感染,必須考慮其他病原感染的可能性,因?yàn)橥獗斫】档拇罂诤邝|中也可以分離到LMBV,LMBV可能并不是導(dǎo)致發(fā)病的主要原因。LMBV的分離與魚(yú)類其他病毒相比較為容易,因?yàn)樵摬《究梢栽谠S多常見(jiàn)細(xì)胞系如鮭科、鯉科、鮰科魚(yú)類細(xì)胞上增殖,引起明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)。但由于病毒在組織中拷貝數(shù)存在差異,有時(shí)病毒的細(xì)胞分離未必成功。2001年7月份美國(guó)阿拉巴馬州進(jìn)行LMBV的流行病學(xué)調(diào)查,采用細(xì)胞培養(yǎng)方法檢測(cè)LMBV陽(yáng)性率為13%,采用PCR方法檢測(cè)得到的陽(yáng)性率為57%?？梢?jiàn),分子生物學(xué)方法如PCR和血清學(xué)方法如ELISA,可以很好地輔助病原的鑒定。此外,采用定量PCR檢測(cè)方法可以精確計(jì)算各感染組織中病毒拷貝數(shù)。在混合感染情況下,LMBV的作用仍然未知?？赡苁瞧渌≡腥緦?dǎo)致機(jī)體免疫力下降,使得LMBV能夠快速增殖到被檢測(cè)水平,也可能是感染LMBV后,魚(yú)類對(duì)其他病原更易感。5感染lm-bv的致病機(jī)制LMBV不僅僅感染大口黑鱸,還感染太陽(yáng)魚(yú)科的小口黑鱸,斑點(diǎn)黑鱸,藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú),紅胸太陽(yáng)魚(yú),白刺蓋太陽(yáng)魚(yú)和黑斑刺蓋太陽(yáng)魚(yú),但目前發(fā)現(xiàn)其只對(duì)大口黑鱸有致死性。ZilbergD等進(jìn)行LMBV的人工感染試驗(yàn),結(jié)果顯示,以106.2TCID50/0.1mL劑量通過(guò)腹腔注射的方式攻毒,感染后第3天,病魚(yú)呈現(xiàn)螺旋狀游動(dòng),第4天病魚(yú)體色發(fā)黑、無(wú)活力、腹部輕度膨大。攻毒魚(yú)在3d~5d內(nèi)全部死亡,瀕死魚(yú)組織中檢測(cè)到病毒含量為107.8~109.2TCID50/g。瀕死魚(yú)剖檢后,觀察到肝臟表面局部蒼白,脾臟鮮紅色,腸系膜和靠近盲腸部位的脂肪有充血現(xiàn)象。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,所有感染魚(yú)都有急性腹膜炎癥狀,這與同種屬病毒DFV和GV6引起的病變不同,后者往往導(dǎo)致造血器官壞死病變。感染LM-BV的魚(yú)肝臟、胃、腸道和脾臟表層部分出現(xiàn)壞死和炎性病變,但是深層部分表現(xiàn)正常。魚(yú)鰾與腹腔接觸表面有纖維蛋白滲出物。胃腸道的黏膜上皮層有局部壞死病灶。所有感染魚(yú)在注射部位有2mm~3mm大小的炎癥病灶,可能是注射引起的一過(guò)性損傷。BerkBH等以1.7×103pfu/mL劑量采用浸泡方式對(duì)225尾平均體重79g的大口黑鱸攻毒,所有瀕死魚(yú)浮在水面,魚(yú)鰾極度膨脹。感染魚(yú)組織器官病毒檢測(cè)顯示,攻毒4d~5d是感染高峰期,魚(yú)鰾、鰓和后腎是最容易受LMBV侵襲的器官。由于在自然環(huán)境下,大口黑鱸隱性帶毒的情況比較普遍,因此LMBV的致病性存在差異。InendinoKR等研究了環(huán)境應(yīng)激因素對(duì)LMBV發(fā)病的影響,試驗(yàn)證實(shí)水體環(huán)境的劇烈變化、飼養(yǎng)密度過(guò)大都會(huì)導(dǎo)致感染LMBV的大口黑鱸病死率上升。單靠LMBV導(dǎo)致魚(yú)災(zāi)在自然條件下可能性并不高,大部分研究人員還是認(rèn)為協(xié)同感染,環(huán)境劇變?nèi)缢疁赝蝗簧仙?、溶氧降?會(huì)導(dǎo)致該病的暴發(fā)。6臨床表現(xiàn)正常的帶毒魚(yú)l改由于LMBV在發(fā)病機(jī)理、流行病學(xué)方面的研究并不深入,再加上野生魚(yú)類帶毒情況的普遍性,目前對(duì)LMBV還沒(méi)有采取有效的防控措施。很多研究者也期望通過(guò)對(duì)各種外界因素與發(fā)病的研究,探討切斷LMBV感染并導(dǎo)致魚(yú)災(zāi)的可能性。GregoryMS等在美國(guó)德克薩斯州進(jìn)行為期數(shù)年的跟蹤調(diào)查,發(fā)現(xiàn)LMBV的感染與外傷、鉤形標(biāo)記、外寄生蟲(chóng)、性別、抓捕方式、體長(zhǎng)、體重等因素均沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。不過(guò),盡管如此,加強(qiáng)日常管理對(duì)于該病的散播和流行仍然是必不可少的。對(duì)于任何新老病原,多數(shù)研究人員提出還是從導(dǎo)致病害發(fā)生的常規(guī)的三個(gè)因素宿主、病原和環(huán)境入手。目前已有研究證明,環(huán)境的惡變會(huì)導(dǎo)致LMBV的暴發(fā),如水溫的升高,溶氧降低,頻繁捕捉等。人工感染試驗(yàn)也已經(jīng)證實(shí),有些魚(yú)一旦感染上LMBV,幾天之內(nèi)就能產(chǎn)生癥狀;同樣條件下,有些魚(yú)不會(huì)產(chǎn)生任何癥狀,但是可以攜帶病毒。說(shuō)明個(gè)體上的差異也是存在的。對(duì)于這些臨床表現(xiàn)正常的帶毒魚(yú),有幾個(gè)疑問(wèn)尚未解決:(1)這些臨床表現(xiàn)正常的魚(yú)是否已經(jīng)從感染中恢復(fù),只是不能將病毒從體內(nèi)清除;(2)這些帶毒魚(yú)以后是否會(huì)發(fā)病;(3)這些帶毒魚(yú)是否已經(jīng)產(chǎn)生抵抗力;(4)這些帶毒魚(yú)其實(shí)已經(jīng)發(fā)病,只是癥狀不明顯。怎樣控制這些無(wú)癥狀帶毒魚(yú)到處傳播病毒是目前防控的難題。從2000年開(kāi)始,美國(guó)私人組織———鱸魚(yú)垂釣愛(ài)好者協(xié)會(huì)(BassAnglersSportsmanSociety,簡(jiǎn)稱BASS)每年發(fā)起并主辦關(guān)于LM-BV的研討會(huì),邀請(qǐng)來(lái)自各州、聯(lián)邦機(jī)構(gòu)、高校的管理者、專家和研究人員共同探討LMBV的解決辦法,這一做法一直持續(xù)到現(xiàn)在,對(duì)于跟蹤LMBV的散播、確定發(fā)病相關(guān)因素起到了非常積極的作用。7大口黑地震病病毒防控的展望從20世紀(jì)90年代開(kāi)始,中國(guó)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸發(fā)生的病害越來(lái)越復(fù)雜,爛鰓病、腸炎病、腐皮病、水霉病、車(chē)輪蟲(chóng)病、杯體蟲(chóng)病等暴發(fā)時(shí)有報(bào)道。導(dǎo)致大口黑鱸發(fā)病的病原主要是嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌、霉菌和寄生蟲(chóng),確診由病毒感染導(dǎo)致發(fā)病的報(bào)道較少,2009年鄧國(guó)成等人報(bào)道的大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的,這也是國(guó)內(nèi)對(duì)LM-BV的首次報(bào)道。經(jīng)過(guò)20多年的馴化飼養(yǎng),大口黑鱸的養(yǎng)殖量在國(guó)內(nèi)頗具規(guī)模,但LMBV在國(guó)內(nèi)還未引起足夠的重視,歸因于其感染性雖然廣泛,但是引起大規(guī)模致死性暴發(fā)的病例報(bào)道并不多,再加上魚(yú)病癥狀復(fù)雜,許多未進(jìn)行病毒分離鑒定的病例也將其簡(jiǎn)單歸結(jié)于細(xì)菌感染。目前,虹彩病毒病的防控方面沒(méi)有特效藥物。在虹彩病毒科的5個(gè)病毒屬中,由于腫大細(xì)胞病毒感染商業(yè)價(jià)值較高的淡水和海水魚(yú)類,其致病機(jī)理和疫苗研發(fā)也一直是近幾年研究的重點(diǎn)。如日本已經(jīng)研發(fā)并商品化真鯛虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)注射型全細(xì)胞滅活疫苗,并且針對(duì)RSIV研發(fā)的DNA疫苗也顯示出良好的保護(hù)效果。但是對(duì)于大部分已經(jīng)報(bào)道的腫大細(xì)胞虹彩病毒來(lái)說(shuō),因?yàn)殡y以實(shí)現(xiàn)在常見(jiàn)魚(yú)類細(xì)胞中增殖,細(xì)胞苗的開(kāi)發(fā)有一定難度。蛙病毒在感染細(xì)胞方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì),不僅可以感染許多魚(yú)類細(xì)胞系,在一些常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)、人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)、人腎上皮細(xì)胞系(293T)上也能進(jìn)行正常增殖