重組桿狀病毒鑒定及病毒滴度的熒光pcr檢測(cè)方法的建立

重組桿狀病毒鑒定及病毒滴度的熒光pcr檢測(cè)方法的建立

本參與、to-bac誘導(dǎo)側(cè)毒表達(dá)系統(tǒng)利用昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)大量外源基因，廣泛用于靶場(chǎng)育種。這一表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于結(jié)合了E.coli菌株快速、簡(jiǎn)便的克隆技術(shù),以及重組蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的高豐度表達(dá)和完善的翻譯修飾機(jī)制。不僅如此,桿狀病毒還有著優(yōu)于許多其他基因系統(tǒng),并且能為各種人類(lèi)疾病提供體內(nèi)體外基因治療方案的潛力。對(duì)桿狀病毒用于基因治療已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究工作,許多研究組也取得了一些實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。不管是基因工程還是基因治療所用的桿狀病毒,都有必要準(zhǔn)確地檢測(cè)重組病毒滴度和鑒定所克隆的外源基因。一般來(lái)說(shuō),滴度的檢測(cè)有賴(lài)于空斑實(shí)驗(yàn)或判斷GFP基因表達(dá)。這些步驟都是耗時(shí)、費(fèi)力并且不準(zhǔn)確。另外,對(duì)于進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn),基因治療載體必須達(dá)到FDA的病毒顆粒要求:使其感染單位比率不少于100。所以,快速、準(zhǔn)確的滴度檢測(cè),將成為病毒基因治療載體應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)前的一個(gè)必需的評(píng)估步驟。為了以上目的,我們建立了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)重組桿狀病毒外源基因拷貝數(shù)的方法,來(lái)測(cè)定重組病毒滴度,這一方法能同時(shí)檢測(cè)重組病毒滴度和鑒定外源基因的正確克隆。1材料和方法1.1重組bacmid的鑒定按照操作手冊(cè),以Bac-to-Bac載體系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒(Bacmid)。含有人IL-18基因的pFastBace-18質(zhì)粒(由我所構(gòu)建)被轉(zhuǎn)入到含有Bacmid的大腸桿菌DH10Bac中。在轉(zhuǎn)入的細(xì)胞中,IL-18基因重組到Bacmid,通過(guò)基因測(cè)序?qū)χ亟MBacmid進(jìn)行鑒定,以上海生工公司的plasmidDNAminiprepskit純化。純化的重組Bacmid以A260/A280判斷純度,并以A260值計(jì)算重組Bacmid含量。TE溶解重組Bacmid,置-20℃保存,用于轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞和作為定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)模板。1.2細(xì)胞愈合培養(yǎng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前,大約2.0×106/孔sf9細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清的Grace培養(yǎng)基(GIBCO)的培養(yǎng)板中,27℃培養(yǎng)24小時(shí)后大約有50%～70%的細(xì)胞匯合。按照LipoFECTIN的操作說(shuō)明,把含有重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體的感染混合物加入到細(xì)胞中,在27℃中培養(yǎng)5小時(shí)后,棄去各孔內(nèi)Grace培養(yǎng)基,加入6ml新鮮培養(yǎng)基,27℃培養(yǎng)72小時(shí),離心收集昆蟲(chóng)細(xì)胞,以昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,離心棄去細(xì)胞碎片,收集上清液作為病毒母液用于空斑實(shí)驗(yàn)和DNA提取。1.3稀釋液的稀釋將sf9細(xì)胞以5×105/孔密度接種到培養(yǎng)板中,以Grace培養(yǎng)基稀釋病毒母液為101～1010系列梯度,每一稀釋度體積為3ml。將每份1ml的稀釋液加入到上述的培養(yǎng)板中,每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)測(cè)定孔,在27℃孵育2小時(shí)。準(zhǔn)備5%的瓊脂溶液加入30ml的Grace培養(yǎng)基在37℃條件下平衡,完全吸去培養(yǎng)板中的Grace培養(yǎng)基,鋪上2ml/孔的瓊脂,在27℃孵育,21天內(nèi),可以肉眼看到小而白的斑點(diǎn)就是空斑。計(jì)算單個(gè)明顯可辨的空斑來(lái)檢測(cè)滴度,將相同容器上所得空斑數(shù)的平均值乘以稀釋因子來(lái)計(jì)算pfu/ml,計(jì)算公式如下:pfu(原始病毒液)。1.4重組人道dna的提取以QIAampBloodMinikit(上海生工)按其操作說(shuō)明來(lái)提取重組桿狀病毒基因組DNA,提取的病毒DNA以TE溶解儲(chǔ)存,用作PCR的模板。1.5病毒pcr檢測(cè)以重組桿狀病毒基因組的人IL-18基因序列設(shè)計(jì)PCR引物和探針,引物和探針?lè)謩e由上海生工公司和上海申友生物公司合成。上游引物F:5′-TGGCTACACTGGTATTCG-3′;下游引物R為:5′-ATAAAGATAGCCAGCCTA-3′;探針為:5′-(FAM)ATTCGTTGCCCAAGCAGTAGTT-(TAMRA)3′,FAM為報(bào)告基團(tuán),TAMRA為淬滅基團(tuán)。101～108系列稀釋度的重組Bacmid作為標(biāo)準(zhǔn)模板,用于方法學(xué)評(píng)價(jià)及提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣的,純化的病毒DNA也稀釋成101～108的稀釋度用于PCR檢測(cè)。25μl的PCR反應(yīng)體系包括上、下游引物各150、20nmol/L探針、200mmol/LdNTP、4.0mmol/LMgCl2、1.5單位的AmpliTaqGold、1×taqMan的緩沖液、2μlDNA標(biāo)準(zhǔn)模板或純化的病毒DNA。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃5分鐘;92℃5秒、60℃30秒,40個(gè)循環(huán)。熒光檢測(cè)采用F1/F2通道,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)測(cè)定管。PCR反應(yīng)完成后,調(diào)節(jié)基線(baseline)至適宜處,各熒光曲線與基線的交叉點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為Ct值(cycleofthreshhold),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度與Ct值對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,可得到各待測(cè)品的初始濃度。2結(jié)果2.1檢測(cè)靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線首先,通過(guò)檢測(cè)系列稀釋的重組Bacmid來(lái)評(píng)價(jià)TapManPCR的相關(guān)性和敏感性。對(duì)10倍稀釋的系列Bacmid進(jìn)行檢測(cè),獲得標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,在101～108稀釋度時(shí)相關(guān)系數(shù)為0.97,標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%,且該方法可檢測(cè)低到只有10個(gè)拷貝的Bacmid,具有很好的相關(guān)性和較高的靈敏度,見(jiàn)圖1。重復(fù)測(cè)定結(jié)果表明,該方法的變異性小于3%。每一稀釋的重組病毒的PCR反應(yīng)均設(shè)三個(gè)重復(fù)反應(yīng)管,與Bacmid的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較,計(jì)算出病毒DNA的含量(vg/ml)。2.2fq-pcr檢測(cè)培養(yǎng)vg/ml的相關(guān)性最后,以空斑方法檢測(cè)生物學(xué)滴度3次。用生物學(xué)方法和用定量PCR方法測(cè)得的滴度之間有很好的相關(guān)性,見(jiàn)表1,檢測(cè)相同的重組病毒母液vg/ml值大約是pfu/ml滴度值的10倍。FQ-PCR明顯的節(jié)省了檢測(cè)滴度的時(shí)間。這些數(shù)據(jù)表明,以外源基因序列設(shè)計(jì)的引物和探針用于病毒的滴度的檢測(cè),在臨床實(shí)驗(yàn)上是可行的。3vp/ml檢測(cè)重組病毒的作用對(duì)于病毒載體介導(dǎo)的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)移,一個(gè)快速而精確的重組桿狀病毒滴度檢測(cè)方法是必要的。傳統(tǒng)檢測(cè)病毒滴度有許多不同的單位,如VP(病毒粒子)、GTU(基因轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)、PFU(空斑形成單位)、CFU(克隆形成單位)、以及TCID等。在這些單位之中,VP是物理學(xué)滴度,其他是生物學(xué)滴度。PFU、CFU和GTU這幾個(gè)單位被廣泛地用于描述病毒的滴度,但是這些單位所使用的滴度檢測(cè)方法耗時(shí)且不準(zhǔn)確,不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果不一樣,并且還依賴(lài)操作者的水平。另外,PFU、CFU、GTU反應(yīng)病毒感染的能力,一般來(lái)說(shuō),PFU、CFU、GTU的值少于真正的病毒數(shù)量,因?yàn)橹挥胁糠种亟M病毒有感染力。當(dāng)需要測(cè)定病毒母液滴度和鑒定重組病毒載體時(shí),用物理學(xué)滴度就比較合適,因此越來(lái)越多的研究者選擇VP為單位。VP通過(guò)測(cè)定病毒的A260值來(lái)計(jì)算,一個(gè)OD大約等于1.1×1012VP,但是這種方法也有很多不足。首先,只有徹底純化的病毒(幾乎為100%)才可以計(jì)算VP;其次,產(chǎn)生重組病毒時(shí),由于一部分重組病毒的基因組沒(méi)有被組裝到病毒顆粒中,最后形成缺陷型病毒顆粒,用VP方法就不能鑒別它們。vg/ml不具有以上種種局限,因此逐漸被研究者所接受,vg/ml描述的是每ml病毒母液中含有的病毒基因組拷貝數(shù)。因?yàn)闂U狀病毒是單克隆DNA病毒,我們相信vg/ml是描述病毒滴度的理想的替代品。在本研究中,實(shí)時(shí)定量PCR被用來(lái)檢測(cè)重組桿狀病毒的vg/ml滴度,這種方法是在較寬的范圍內(nèi)(每反應(yīng)在101～108個(gè)拷貝數(shù))測(cè)定病毒滴度。我們還發(fā)現(xiàn),在檢測(cè)同樣的重組病毒母液,vg/ml值為pfu/ml值的10倍,這種現(xiàn)象可能是由于病毒感染的空斑形成效率造成的。從理論上講,Bac-to-Bac系統(tǒng)中并沒(méi)有野生型或缺陷型病毒產(chǎn)生。因此通過(guò)vg/ml單位描述重組桿狀病毒質(zhì)粒數(shù)量比