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人工模擬ppk1缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究
細(xì)菌腦膜是一種常見的嚴(yán)重感染疾病,尤其是對于不完整的新生兒。發(fā)病率和死亡率很高。引發(fā)新生兒細(xì)菌性腦膜炎的常見病原菌有大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、B族溶血性鏈球菌、單核增多李斯特菌、變形桿菌、流感桿菌等。其中大腸桿菌是最常見的導(dǎo)致新生兒腦膜炎的革蘭陰性菌,且以有Kl莢膜多糖的Kl株占絕大多數(shù)。盡管針對腦膜炎已開展了許多研究,但其具體的致病機(jī)制仍有許多未知之處,給E.coliK1引發(fā)的新生兒腦膜炎的治療或者藥物開發(fā)造成許多困難。聚磷酸鹽激酶1(Polyphosphatekinase1,PPK1)是E.coli內(nèi)一種與聚磷酸鹽合成有關(guān)的激酶,負(fù)責(zé)可逆性催化ATP脫磷酸殘基生成ADP及聚磷酸鹽,而聚磷酸鹽是生物體內(nèi)普遍存在的一種線性無機(jī)鹽聚合體。PPK1由ppk1基因編碼。研究發(fā)現(xiàn),ppk1與一些細(xì)菌的毒力或者壓力適應(yīng)性相關(guān)。E.coliK-12株缺失ppk1基因后,對溫度、高滲等條件刺激的抵抗力下降;敲除綠膿桿菌ppk1基因后會導(dǎo)致細(xì)菌菌膜形成能力減弱;傷寒沙門氏菌的ppk1缺失株對腸上皮細(xì)胞侵襲能力降低。但ppk1在E.coliK1株致腦膜炎中的作用和機(jī)制并不清楚。本研究主要根據(jù)基因同源重組的原理,利用自殺質(zhì)粒構(gòu)建E.coliK1株的ppk1缺失株,并對其功能進(jìn)行初步探索,為深入研究E.coliK1致腦膜炎的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1樣品及其思考質(zhì)粒RS218株(從臨床新生兒腦膜炎患者腦脊液中分離的大腸桿菌K1株,E44為具有利福平抗性的RS218株)、DH5α和SM10λpir及自殺質(zhì)粒pCVD442由本實驗室保存;T載體購自大連TaKaRa公司。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Humanbrainmicrovascularendothelialcells,HBMEC)由美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院KwangSikKim教授惠贈。1.1.2試劑與檢測方法限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶購于大連TaKaRa,細(xì)菌全基因組提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA回收純化試劑盒、DNAmarker、瓊脂糖購于廣州東盛,其余試劑為國產(chǎn)分析純。胎牛血清、培養(yǎng)基DMEM和胰酶購于美國Hyclone。細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國Heraeus;酶標(biāo)儀,美國Bio-Rad;分光光度計,上海美譜達(dá)。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒pck1的構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)。根據(jù)已測定的E44染色體上的ppk1基因及其兩側(cè)的DNA序列,設(shè)計合成2對引物PKE-S1、PKE-B1及PKE-B2、PKE-X2(表1),以E44染色體為模板,用PCR分別擴(kuò)增ppk1基因兩端1.14kb的A片段和1.28kb的B片段。PCR擴(kuò)增條件為:94°C3min;94°C30s,56°C30s,72°C90s,30個循環(huán);72°C10min。將擴(kuò)增得到的A、B片段分別連接到pGEM-T載體上。利用共同的BamHⅠ位點將兩個片段連接起來成為AB片段(2.42kb),然后將其亞克隆至自殺質(zhì)粒pCVD442中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCVDPK1;將其轉(zhuǎn)化到自殺質(zhì)粒允許宿主菌SM10λpir,并根據(jù)接合性轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理將自殺質(zhì)粒pCVDPK1從SM10λpir轉(zhuǎn)到E44中,通過氨芐敏感性及PCR方法篩選出ppk1基因缺失株(自殺質(zhì)粒上攜帶的缺少ppk1的側(cè)翼序列連接片段AB,會與E44染色體發(fā)生同源重組,替換掉E44上的同源片段,從而使ppk1被剔除),ppk1基因缺失株命名為Δppk1。利用重組片段兩端引物PKE-S1、PKE-X2以及ppk1上下游引物PKE5、PKE3進(jìn)行敲除株的PCR鑒定,并進(jìn)行測序鑒定。1.2.3生存率測定h2將E44、Δppk1按1:100比例加入含有100mg/L利福平的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中,37°C靜置培養(yǎng)過夜。將細(xì)菌10000r/min離心2min,收集細(xì)菌并用PBS重懸。測OD600并調(diào)至約1.0。加入H2O2至終濃度分別為0、10、20、30、40、50mmol/L,然后將樣品置于37°C孵育15min。孵育結(jié)束后取100μL樣品做10倍梯度稀釋并涂布于含利福平的LB平板。將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,計數(shù)平板菌落數(shù)。實驗重復(fù)3次并取均數(shù)作出生存率曲線圖。生存率計算方法:(接受處理后生存的細(xì)菌數(shù)/處理前的細(xì)菌數(shù))×100%。1.2.4tri能力檢測細(xì)胞感染黏附實驗參考文獻(xiàn)。實驗前48h將HBMEC培養(yǎng)于24孔板內(nèi),并生長匯合至單層。細(xì)菌接種物用不含抗生素的培養(yǎng)基重懸。以每孔1×107的細(xì)菌量放入培養(yǎng)HBMEC細(xì)胞的24孔板內(nèi)(使細(xì)胞感染倍數(shù)為100),在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中共同孵育120min。為計算黏附細(xì)胞的細(xì)菌數(shù),細(xì)胞用培養(yǎng)基洗3次,加入100μL0.5%TritonX-100裂解細(xì)胞(此濃度TritonX-100在0.5h之內(nèi)不會影響細(xì)菌活性),孵育8min后,立即加入50μL蒸餾水。在溶解細(xì)胞之前的孵育和清洗階段,單層細(xì)胞都要保持完整。反復(fù)吹打后吸出樣品,做梯度稀釋(10-1-10-4)后涂羊血平板計數(shù)菌落數(shù)。黏附率=黏附細(xì)菌數(shù)/孵育細(xì)菌數(shù)×100%,重復(fù)3次取平均值。1.2.5hbmec活性檢測大腸桿菌K1株體外誘導(dǎo)HBMEC的細(xì)胞毒效應(yīng)可以通過測定釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基的LDH酶活性來表示。將待測菌靜置于37°C培養(yǎng)至穩(wěn)定期,用無菌PBS稀釋后,取約107細(xì)菌接入?yún)R合的HBMEC單層中。37°C孵育2、4、6h后,取上清按乳酸脫氫酶檢測試劑盒LD-L50Kit(Sigma)說明書測HBMEC的LDH釋放活性。陰性對照為不加菌各時間點LDH本底活性,總LDH活性為HBMEC全細(xì)胞裂解后釋放的LDH活性。結(jié)果表示為實驗組LDH活性/總LDH活性×100%。LDH釋放活性的大小間接反應(yīng)了細(xì)胞膜的受損程度。2結(jié)果2.1敲除株生物量和生長曲線由圖1的生長曲線可以得知,野生株E44在低營養(yǎng)的MOPS培養(yǎng)基中生長能力明顯強(qiáng)于基因敲除株Δppk1。約2-3h野生株進(jìn)入對數(shù)生長期,14h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期,而敲除株的生長曲線沒有太大變化,一直維持在一個較低的水平。同時我們還測定了二者在營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ppk1缺失并不影響E.coliK1株E44在營養(yǎng)豐富的環(huán)境中的生長能力,野生株與敲除株二者的生長曲線基本保持一致,同樣約2-3h進(jìn)入對數(shù)生長期,14h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期(圖2)。2.2ppk1敲除株與野生株生存率比較由圖3的生存率曲線可以看出,給予10-50mmol/L五個濃度H2O2的氧化刺激后,ppk1敲除株在各個濃度下的生存率均比野生株要低。該結(jié)果顯示ppk1基因?qū)τ贓.coliK1抵抗氧化刺激有重要作用。2.3野生株與敲除株hbmec黏附率根據(jù)黏附率計算公式計算出各組細(xì)菌對于HBMEC的黏附率,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),野生株E44黏附率為(9.80±0.95)%,敲除株Δppk1為(3.87±0.68)%,陰性對照組DH5α為(0.08±0.03)%,野生株對于HBMEC的黏附率明顯高于敲除株組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),如圖4所示。2.4ppk1孵育組與2.2ppk1不同時點,2.細(xì)菌與HBMEC孵育后,野生株組HBMEC在2、4、6h的LDH釋放活性分別為17.83±1.61、22.80±1.23、31.37±1.72,而Δppk1孵育組則降低至14.13±1.16、18.55±0.96、26.19±1.70,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。結(jié)果提示敲除ppk1基因后,大腸桿菌E44對細(xì)胞膜損傷作用減弱,致使HBMEC的LDH釋放減少。3hbmec與ppk1基因缺失株e.colik1的生長曲線及其聯(lián)系ppk1基因在多種微生物體內(nèi)是一個保守的基因。由于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)PPK1同源物的存在,使其成為一個藥物開發(fā)的潛在靶位。值得注意的是,在一些細(xì)菌內(nèi)不僅有PPK1還有PPK2的存在,同樣也與聚磷酸鹽的合成有關(guān),負(fù)責(zé)可逆性催化GTP脫磷酸殘基形成GDP和聚磷酸鹽。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),聚磷酸鹽可以影響某些調(diào)控基因比如rpos的表達(dá),而這些調(diào)控基因可能參與了多個與致病菌環(huán)境壓力適應(yīng)性或毒力相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控。E.coliK1跨越人體血腦屏障最終引發(fā)腦膜炎有幾個關(guān)鍵性的環(huán)節(jié):高濃度的菌血癥、細(xì)菌黏附、侵襲HBMEC、誘導(dǎo)HBMEC的細(xì)胞骨架重排及相關(guān)信號通路的激活,最終成功穿越HBMEC。HBMEC是人體血腦屏障的主要組成部分,黏附于細(xì)胞表面是細(xì)菌進(jìn)入HBMEC的第一步,然后通過Zipper機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞,并以空泡的形式穿越HBMEC。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)敲除ppk1基因后,大腸桿菌K1株E44黏附HBMEC的能力明顯下降。而通過檢測乳酸脫氫酶的釋放活性我們發(fā)現(xiàn),ppk1基因缺失株與HBMEC孵育后,LDH釋放明顯減少,這提示了該組細(xì)胞膜受損程度較野生株孵育組減輕,致病菌對細(xì)胞的毒性效應(yīng)降低。在臨床細(xì)菌性腦膜炎患兒的腦脊液中,??煞蛛x培養(yǎng)出病原菌。而致病菌突破血腦屏障后,進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔,在相對低營養(yǎng)的腦脊液中生長存活也與其引發(fā)腦膜炎有重要關(guān)系。另外,E.coliK1其致腦膜炎過程中也有可能面臨其他一些可能的營養(yǎng)缺乏的環(huán)境。為了檢測ppk1是否與E.coliK1在低營養(yǎng)環(huán)境下的生長有關(guān),我們測定了野生株E44及敲除株Δppk1在營養(yǎng)限制性的MOPS培養(yǎng)基中的生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ppk1基因缺失后,E.coliK1株E44在低營養(yǎng)環(huán)境中的生長受到明顯抑制。在機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過程中,吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌并利用氧化作用將其殺傷是重要的防御機(jī)制。故E.coliK1株抵抗住可能存在的氧化壓力是其進(jìn)一步誘發(fā)腦膜炎的條件之一。通過分析比較野生株和敲除株在不同濃度氧化劑H2O2刺激下的生存率,我們還發(fā)現(xiàn)ppk1基因在E.coliK1株E44抵抗氧化壓力的過程中扮演了重要角色。本文通過構(gòu)建E.coliK1ppk1基因缺失株,對其在低營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生存能力,以及體外黏附HBMEC能力和對HBMEC的毒性作用進(jìn)行了考察。結(jié)果表明ppk1基因缺失后將導(dǎo)致E.coliK1在低營養(yǎng)環(huán)境以及氧化壓力中的生存能力降低,對HBMEC的黏附能力和損傷作用也減弱。這些結(jié)果為我們下一步進(jìn)行其他體內(nèi)外實驗,并為最終闡明PPK1在E.coliK1致新生兒腦膜炎中的相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)和數(shù)據(jù)采集將E44、Δppk1按1:100比例加入含有100mg/L利福平的Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中,37°C靜置培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的細(xì)菌接種至低營養(yǎng)MOPS(Potassiummorpholinopropanesul
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