安徽大別山森林土壤球孢白僵菌種群遺傳多樣性的issr分析

安徽大別山森林土壤球孢白僵菌種群遺傳多樣性的issr分析

白僵尸病毒是一種常見的、可引起昆蟲白僵尸疾病的細(xì)菌。目前已被開發(fā)用于真菌殺蟲劑,并被廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林害蟲。不同的森林生態(tài)系統(tǒng)中蟲生真菌群落多樣結(jié)構(gòu)差異極大,其中球孢白僵菌的相對多度、優(yōu)勢度以及季節(jié)分布差異也很大。而且已知白僵菌自然種群中存在較大的異質(zhì)性和較高的遺傳多樣性。但目前對不同森林生態(tài)系中的白僵菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性水平的研究報道較少?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為真菌遺傳結(jié)構(gòu)的研究提供了愈來愈精確和可靠的分子標(biāo)記。尤其是由Zietkiewicz等創(chuàng)建的ISSR(簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)分子標(biāo)記,由于其引物序列較長,退火溫度高,具有更高的重復(fù)性,且操作簡單,已被廣泛用于檢測種內(nèi)遺傳變異。筆者擬應(yīng)用該技術(shù)對麻姑山馬尾松純林、瑯琊山天然次生林的白僵菌種群遺傳多樣性進(jìn)行研究,并結(jié)合李旻等對大別山原始林中球孢白僵菌遺傳多樣性的研究,綜合分析不同森林生態(tài)系中球孢白僵菌的遺傳多樣性指數(shù)以及基因流、遺傳分化等。旨在揭示白僵菌自然群體在不同森林生態(tài)系中的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性,推測不同生態(tài)系中白僵菌基因交流狀況。1材料和方法1.1真菌蟲株的篩選分別于2005年3月至2006年1月和2007年3月至2008年1月在安徽省滁州市瑯琊山國家森林公園和安徽省宣州市麻姑山馬尾松林場隨機(jī)設(shè)置樣地采集感染真菌蟲尸,經(jīng)分離、純化,共得到采集自瑯琊山的白僵菌496株,采集自麻姑山的白僵菌111株?，F(xiàn)保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點實驗室。從瑯琊山群體中隨機(jī)挑選出111株球孢白僵菌與麻姑山白僵菌群體比較研究。所選的白僵菌群體在安徽省的分布見圖1,各群體所在地及其生境狀況見表1。1.2培養(yǎng)條件設(shè)置將供試菌株接種到加鋪玻璃紙SDAY培養(yǎng)基上。置于光照培養(yǎng)箱中(25±1)℃培養(yǎng)6d左右。待大量產(chǎn)生菌絲后,從玻璃紙上剝離菌體,凍干菌絲備用。1.3提取dna和依斯r索引物質(zhì)采用改進(jìn)的CTAB方法提取菌體總DNA,用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。參考文獻(xiàn),選出合適的引物序列(表2)。1.4pcr擴(kuò)增及電泳檢測ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在FlexigenePCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系(15μl)如下:1.5μl10×PCRBuffer,0.25μldNTPs,0.6μl引物,0.5UTaqDNA聚合酶和20ng模板DNA。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min,接著進(jìn)行35個循環(huán);94℃變性45s,48～54℃復(fù)性45s,72℃延伸1.5min。循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離,EB染色后用GIS-2008凝膠成像系統(tǒng)檢測拍照。用AlphaEaseFC軟件分析數(shù)據(jù)。1.5條帶遷移率分析將電泳圖譜利用BandScanV5.0軟件進(jìn)行電泳條帶遷移率分析,把同一遷移率的條帶視為公共帶,其余為特異帶,表示有多態(tài)性。分別記為“1”(代表顯性基因)和“0”(代表隱性基因),把遷移率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成0、1矩陣。1.5.1多態(tài)位點的比例多態(tài)位點百分率(PPL)就是在所有檢測到的位點中多態(tài)位點所占的比率。計算公式為:PPL=多態(tài)位點數(shù)/檢測到的位點總數(shù)×100%。1.5.2物種均勻度指數(shù)Shannon-Wienner指數(shù)來源于信息理論,指數(shù)越高,群落所含的信息量越大,此外還反映物種的均勻度。其計算公式為:I=-∑Pilog2Pi。式中,Pi為某一擴(kuò)增帶出現(xiàn)的頻率。1.5.3平均位點雜合度平均雜和度是指各個亞種群在某微衛(wèi)星位點平均雜合子的比例。假設(shè)一個標(biāo)記位點上n個等位基因的頻率分別為P1,P2,…,Pn,則j=∑i=1mP2i,He=1?∑i=1mP2i,J=IL∑i=1mji,H=1?J=1?IL∑i=1mjij=∑i=1mΡi2,Ηe=1-∑i=1mΡi2,J=ΙL∑i=1mji,Η=1-J=1-ΙL∑i=1mji。式中,j為位點純合度;He為位點雜合度;J為平均位點純合度;H為平均位點雜合度;L為位點數(shù),m為某位點的等位基因數(shù),pi為某位點第i個等位基因的頻率。1.5.4基因數(shù)ni實際觀察等位基因數(shù)為種群在該位點實際測到的等位基因數(shù)目,有效等位基因數(shù)(Ne)是位點純合度的倒數(shù),反映了基因間的相互影響,也可作為遺傳變異的一個測度。Ne=1/j=1/∑i=1mP2i=1/(1?He)Νe=1/j=1/∑i=1mΡi2=1/(1-Ηe)。1.5.5種群雜度的計算遺傳分化系數(shù)(Coefficientofgenedifferentiation,Gst)的計算公式為:Gst=(HT-HS)/HT。式中,HT為種群總雜合度;Hs為亞種群雜合度,即各亞種群平均雜合度。Gst越高,Hs/HT值就越小,表明亞種群遺傳分化對種群總遺傳分化貢獻(xiàn)越小。2結(jié)果與分析2.1引物的擴(kuò)增結(jié)果對所合成的ISSR引物進(jìn)行篩選,選擇了擴(kuò)增結(jié)果較穩(wěn)定、多態(tài)性好的7個引物對瑯琊山群體和麻姑山群體共222株個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時引用李旻等對大別山球孢白僵菌群體研究結(jié)果進(jìn)行比較研究。該研究中7個引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目從5到12不等,共擴(kuò)增得到58個清晰的條帶,其中多態(tài)性條帶56個,占96.55%。引物P08的擴(kuò)增結(jié)果見圖2?，樼鹕椒N群、麻姑山種群和大別山種群3個群體的多態(tài)性位點分別為96.55%、93.10%和81.00%(表3)。由表3可以看出,瑯琊山群體的多態(tài)位點最高,大別山群體的多態(tài)位點最低,這可能是由于供試菌株較少造成的。但大別山群體的Nei’s基因多樣性He和Shannon’s信息指數(shù)I分別為0.3187、0.4782,為3個不同森林生態(tài)系群體最大,其中人工純林麻姑山群體Nei’s基因多樣性He和Shannon’s信息指數(shù)I最小,分別為0.2552、0.3825。2.2群體遺傳分化和基因流變根據(jù)總的基因多樣性(Ht)和群體內(nèi)基因多樣性(Hs)計算不同群體間的分化水平(Gst),結(jié)果得到瑯琊山群體和麻姑山群體間的遺傳分化系數(shù)Gst=0.1283,表明這2個群體總的遺傳變異中有12.83%存在于群體間;群體內(nèi)的遺傳變異為87.17%,說明遺傳變異主要來源于群體內(nèi)?；蛄鱊m=3.3984,群體間的基因流值若小于1(Nm<1),有限的基因流就是促使群體發(fā)生遺傳分化的主要原因。該研究結(jié)果表明,種群內(nèi)變異是促使種群間發(fā)生遺傳分化的主要原因。李旻等研究大別山白僵菌群體總基因多樣性(Ht)為0.3129,群體內(nèi)基因多樣性(Hs)為0.2807,按菌株的不同采集季節(jié)分析基因分化系數(shù)Gst為0.1028,說明大別山白僵菌的遺傳變異亦主要是來源于種群內(nèi)。可以看出3種不同森林生態(tài)系中球孢白僵菌各種群間的遺傳分化系數(shù)都較小,可能與球孢白僵菌生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)有關(guān)。2.3認(rèn)識主體資格與聚類分析根據(jù)Nei’s遺傳距離,利用UPGMA法構(gòu)建了采集自瑯琊山和麻姑山白僵菌個體的遺傳關(guān)系聚類圖(圖3)。由圖3可以看出,采集自同一森林生態(tài)系中的球孢白僵菌具有相似的基因型,瑯琊山菌株明顯聚在一起,麻姑山菌株聚為另一支。3不同種類球孢白難以菌群的遺傳多樣性研究結(jié)果表明,瑯琊山球孢白僵菌群體多態(tài)位點比率最高,為96.55%,大別山球孢白僵菌群體多態(tài)位點比率最小,為81.00%。這可能與不同林區(qū)采集到球孢白僵菌菌株的多少有關(guān),菌株越少出現(xiàn)多態(tài)位點的比率越小;大別山球孢白僵菌的Nei’s基因多樣性(He)和Shannon信息指數(shù)(I)都為最高,分別為0.3187、0.4782;麻姑山白僵菌群體的Nei’s基因多樣性(He)和Shannon信息指數(shù)(I)都為最小,分別為0.2552、0.3825;瑯琊山群體其次,分別為0.2781和0.4299?？梢姶髣e山生態(tài)環(huán)境復(fù)雜的原始森林,盡管采集到的白僵菌菌株較少,但是其遺傳多樣性指數(shù)最高。而海拔較低的麻姑山林場是丘陵崗地,林分是人工純林馬尾松林,在林農(nóng)交界處,完全處于人為干預(yù)的影響下,其球孢白僵菌遺傳多樣性指數(shù)則較低。人為干擾較少的天然次生林瑯琊山森林公園白僵菌種群的遺傳多樣性指數(shù)居中。利用Nei’s遺傳距離結(jié)合UPGMA的聚類分析結(jié)果,將采集自瑯琊山和麻姑山的222株球孢白僵菌基本按不同采集地分為了2個遺傳組。周娜等利用ISSR技術(shù)研究了采集自不同區(qū)域的紫色野村菌種群異質(zhì)性時,發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律,利用UPGMA方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹將22株紫色野村菌按照2個不同采集區(qū)域分為2個類群。這說明空間距離對真菌的基因交流