血清白球蛋白的分離、純化及鑒定-10-10

血清白蛋白、γ-球蛋白的分離、純化及鑒定目的要求(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。

(二)了解柱層析技術(shù)。分工合作鹽析混勻時需要兩個人合作。色譜柱專人收集洗脫液，專人檢測樣品是否流出。脫鹽、純化兩次操作類似，都有動手的機會。操作一、鹽析－－白蛋白、γ球蛋白的粗分離<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液，

緩慢滴入，邊加邊搖（？）。<3>混勻后于室溫中放置10min。（一）分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要（二）分離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段：①材料的選擇和預(yù)處理②破碎細胞及提取（有時還需要進行細胞器的分離）③分離純化：包括粗分級分離和細分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。選擇材料破碎細胞提取分離純化分析及鑒定常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀分子大小透析、超過濾密度梯度離心、凝膠過濾帶電特性電泳、離子交換層析吸附特性吸附層析對配體分子的親和性依據(jù)性質(zhì)方法用于粗分用于細分親和層析、金屬螯合層析一、鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。鹽析法的優(yōu)點：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。鹽析的基本原理蛋白質(zhì)水溶膠的穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域，中和電荷，破壞親水溶膠溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in++++++++++++++++等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）中性鹽的選擇常用的中性鹽：(NH4)2SO41)溶解度大：

0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3

103

Na2SO4

4.918.943.342.2

NaH2PO41.67.893.8

101硫酸銨在0℃時的溶解度，遠遠高于其它鹽類2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達數(shù)年之久。4)價格便宜，廢液不污染環(huán)境。分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度飽和析出析出1)清蛋白等電點是4.0，α2球蛋白等電點是5.06，β球蛋白等電點是5.1，γ球蛋白等電點是7.1。2)清蛋白的分子量遠小于球蛋白色譜法chromatography脫鹽和純化——石油醚（流動相M）植物葉子的石油醚萃取液(樣本)碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特一．基本概念色譜法：利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、電荷等），使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相叫固定相，另一個相流過此固定相叫流動相。由于各組分受流動相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動速度，從而使結(jié)構(gòu)上具有微小差異的各組分得到分離的過程，稱之為色譜法。二．特點1、高效能2、高度選擇性3、高靈敏度4、操作簡單不足之處：定量精確，但定性較差色譜三、色譜的種類氣相色譜液相色譜氣－液色譜氣－固色譜液－液色譜液－固色譜1、吸附色譜法2、分配色譜法3、離子交換色譜法4、凝膠色譜法5、親和色譜法按原理分類二、脫鹽（凝膠層析法）透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)超過濾——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液凝膠層析又叫分子篩層析。

具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩：

葡聚糖凝膠（Sephadex）

型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15

分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽

瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA）

孔徑大，用于分離大分子物質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）原理：1、分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；2、小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。

離子交換色譜（ionexchangechromatography）以離子交換劑為固定相，利用樣品中不同的生物大分子的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強弱不同，而將混合物中的不同離子進行分離的色譜技術(shù)。三、純化（離子交換色譜法）陽離子交換劑（cationexchanger）兩種離子交換劑陰離子交換劑（anionexchanger）R-SO3－H++Na+←→R-SO3Na+

+H+R-NH4＋

OH－+Cl－←→R-NH4+

Cl－+OH－離子交換劑的化學(xué)成分1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑?。?、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大。通過改變鹽濃度，輔助改變pH值進行梯度洗脫。陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素陽離子交換層析過程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強度洗脫液洗高離子強度洗脫液洗加樣平衡液洗收集球蛋白中：α及β球蛋白的pI＜6.5，帶負電而γ球蛋白的pI＞6.5(pI7.3)，帶正電γ球蛋白先洗脫出來。白蛋白中：α、β及白蛋白均帶負電，掛于柱上先用低鹽洗去α、β球蛋白再用高鹽競爭洗下白蛋白DEAE纖維素陰離子交換層析:本次實驗純化采用操作一、鹽析

－－白蛋白、γ球蛋白的粗分離

<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液，

緩慢滴入，邊加邊搖（？）。<3>混勻后于室溫中放置10分鐘。

<4>

8000r/min×10min<5>小心吸取上清液，