柞樹(shù)樹(shù)皮中紫杉烷類化學(xué)成分的液相色譜分析

柞樹(shù)樹(shù)皮中紫杉烷類化學(xué)成分的液相色譜分析

子牙烷基物是在蘑菇科蘑菇植物中分離出的一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)的雙殼異合物。由于其中某些成分具有獨(dú)特的抗癌機(jī)理和顯著的療效,因此被公認(rèn)為當(dāng)今世界上最好的的抗癌新藥之一。紫杉烷類化合物主要來(lái)源于紅豆杉植物體,但紅豆杉已被列為世界瀕危物種,資源極為短缺。運(yùn)用生物和化學(xué)合成手段是合成紫杉醇類似物的有效途徑,但尋找新紫杉烷類化合物來(lái)源仍是解決紅豆杉資源短缺的有效途徑。柞樹(shù)(QuercusmongolicaFisch.)為殼斗科櫟屬植物。主要分布在東北、山東、河北、山西和內(nèi)蒙古等地區(qū),其資源蘊(yùn)藏量極大。本文通過(guò)HPLC手段檢定,發(fā)現(xiàn)柞樹(shù)皮中可能含有部分紫杉烷類成分。這些紫杉烷類化學(xué)成分可以作為合成紫杉醇的前體物質(zhì)。1儀器、試劑和儀器高效液相色譜儀(Agilent1100),紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日立U-2800),高速冷凍離心機(jī)(AnkeGL-20G-Ⅱ),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph),循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B95),低溫冷卻,液循環(huán)泵(BLSB10/20),超聲波清洗器(KQ-500E),紫杉醇對(duì)照品(美國(guó)藥典,純度99.66%),甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)材料采自吉林,由吉林蠶業(yè)科學(xué)研究院呂繼業(yè)研究員提供。2測(cè)量條件和方法2.1檢測(cè)條件及檢測(cè)波長(zhǎng)PFP柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(10:42:48);流速:1.0ml·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):227nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣體積:5μL.采用標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法和保留時(shí)間定性。2.2紫杉烷類化學(xué)成分分離PFP柱對(duì)出峰較早的紫杉烷類化合物有較好的分離。這使得在用HPLC測(cè)定紫杉烷類化學(xué)成分含量時(shí),減少了雜質(zhì)的干擾,測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確可信。故選用PFP柱。2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)紫杉醇標(biāo)樣進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,發(fā)現(xiàn)紫杉醇在227nm處有最大吸收,故選擇227nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。2.4溶液制備2.4.1藥渣的提取精密稱取柞樹(shù)皮10.0g置于250ml三角燒瓶中,乙酸乙酯-丙酮(1∶1)100ml室溫浸泡過(guò)夜,超聲2h,離心,傾出上清夜.藥渣再用上述溶劑50ml如法提取1次。合并上清夜,45℃水浴減壓蒸發(fā)至干,甲醇溶解,離心,取上清液,定容于25ml容量瓶中。取部分溶液,用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),待測(cè)。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備精密稱取紫杉醇對(duì)照品50.64mg于100ml中以甲醇溶解并定容,即得對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5047mg.ml-1)。3分析與評(píng)價(jià)3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精確吸取上述對(duì)照品貯備液0.10,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00mL,分別置于10.0mL量瓶中,用流動(dòng)相定容后搖勻,即得不同濃度的對(duì)照品溶液.各進(jìn)樣5μl,以峰面積Y為縱坐標(biāo),濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:y=9.991*103x+1.443(R=1.0000).在0.005—0.50mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.2紫杉醇與最近峰的分離取濃度為0.5047mg.ml-1對(duì)照品溶液進(jìn)樣,以紫杉醇計(jì)算理論塔板數(shù)為12031,供試樣品中,紫杉醇與最近峰的分離因子為1.45。3.3精密度實(shí)驗(yàn)取0.5047mg·ml-1對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定其峰面積,計(jì)算RSD為1.23%.表明測(cè)定方法有良好的精密度。3.4測(cè)定次數(shù)及穩(wěn)定性取1個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,每隔2h測(cè)定一次,連續(xù)測(cè)定6次,結(jié)果顯示在日內(nèi)測(cè)定結(jié)果基本穩(wěn)定。建議測(cè)定應(yīng)在1天內(nèi)完成。綜上所述,實(shí)驗(yàn)擬定的液相色譜條件具有良好的測(cè)定精度。4結(jié)果與討論4.1測(cè)量結(jié)果制備的樣品液按色譜條件進(jìn)行分析,與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖的保留時(shí)間相對(duì)照。見(jiàn)圖-1,圖-2。結(jié)果見(jiàn)表-14.2樣品的提取本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC方法從柞樹(shù)樹(shù)皮中檢定出7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇和10-去乙?；仙即家约?-表-10-去乙酰基紫杉醇。為尋找合成紫杉醇的前體物質(zhì)提供了參考依據(jù)。在樣品的提取中,以往文獻(xiàn)多用甲醇提取,但其明顯缺點(diǎn)是雜質(zhì)峰很多,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)干擾很大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法作了一定的改進(jìn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用乙酸乙酯-丙酮(1∶1)提取方法,可以減少許多雜質(zhì)峰的干擾。經(jīng)外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)