依莎褐蛋雞和艾維茵肉雞發(fā)育正常及緩慢雞群盲腸細菌種群結(jié)構和多樣性研究

依莎褐蛋雞和艾維茵肉雞發(fā)育正常及緩慢雞群盲腸細菌種群結(jié)構和多樣性研究

雞腸是一個復雜多樣的生態(tài)環(huán)境。有400多種微生物。這些微生物在促進酶原的正常發(fā)育和養(yǎng)分吸收方面發(fā)揮著重要作用。長期以來,微生物鑒別方法主要利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或是形態(tài)學法進行細菌組成即細菌分類鑒定和菌群結(jié)構的研究,這些方法存在耗時長,特異性差,靈敏度低等問題,隨著基于16SrDNA分子技術發(fā)展,更全面更深入的了解微生物菌落結(jié)構,其中DGGE/TGGE技術被用于檢測人類、豬和雞等動物胃腸道主要細菌的結(jié)構和多樣性,但受DGGE方法的限制,只能檢測到樣品中含量在1%左右的細菌。目前,宿主與腸道微生物的相互作用,會對宿主的營養(yǎng)、生理以及免疫產(chǎn)生嚴重的影響。腸道菌群失調(diào)會間接影響機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,降低機體免疫力,削弱腸道的屏障功能,影響家畜的生長和健康。家禽品種、飼養(yǎng)環(huán)境以及飼養(yǎng)方式都可能影響腸道菌群,使腸道菌群的研究很難標準化,倪學勤等利用PCR-DGGE技術分析蛋雞MHC基因與商品蛋雞對腸道細菌種群結(jié)構的影響,結(jié)果表明不同宿主基因影響蛋雞不同周齡、不同腸段細菌群落的結(jié)構。Lovanh等運用PCR-DGGE技術對雞舍中不同位置的44個雞糞樣品進行了分析,結(jié)果顯示革蘭氏陽性菌乳桿菌目、芽孢桿菌目和放線菌類在雞糞微生物群落結(jié)構中占主導地位。但有關家禽發(fā)育正常、遲緩和日齡效應對腸道菌群的影響,未見相關報道。本試驗通過改進以往PCR-DGGE方法,對飼養(yǎng)管理和飼養(yǎng)條件相同的依莎褐蛋雞和艾維茵肉雞發(fā)育正常、遲緩雞群盲腸內(nèi)容物菌群16SrDNA基因的DGGE指紋圖譜比較分析,研究家禽品種對不同周齡、發(fā)育雞群盲腸細菌種群結(jié)構和多樣性的影響,針對不同雞群盲腸正常菌群分析,旨在為研制微生態(tài)制劑提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1布署不同雞群盲腸內(nèi)容物的制備試驗利用飼養(yǎng)在山東省臨沂某飼養(yǎng)場不同養(yǎng)殖分場依莎褐蛋雞和艾維茵肉雞(飼養(yǎng)環(huán)境、飼料條件相同),分別在無菌的狀態(tài)下取4、6、10、16、20和40周齡蛋雞以及1、2、4、6、7和8周齡肉雞生長發(fā)育正常、遲緩雞群盲腸內(nèi)容物,并將5只相同雞群盲腸內(nèi)容物均勻混合,然后按0.2g/管分裝到2mL離心管,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2藥品和試劑TaqDNA聚合酶及PCR反應緩沖液購自Takara,Otsu,japanRocheDiagnosticsK.K.(日本);PCR引物由LaboratoryofAnimalGeneticsOkayamaUniversityofGuelph合成;DGGE成套試劑購自Bio-Rad公司(Bio-RadLaboratories,K.K.日本);QIAamp?DNAStoolMiniKit和QIAprep?SpinMiniprepKit購自QIAGEN公司(日本);TOPOTACloning?Kit購自BiodynamicsLabora-toyInc公司(日本);銀染藥品和試劑購自ThermoFisherScientificK.K.公司(ThermoFisherScientificK.K.日本)。310型DNA測序儀(ABIPRISM?310GeneticAnalyzer,LaboratoryofAnimalGeneticsOkayamaUniversityJapanOkayama)。1.3細菌總dna提取參照文獻,采用QIAamp?DNAStoolMiniKit,按照操作手冊提取細菌總DNA。用核酸濃度測定儀測定總DNA濃度,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.4pcr擴增條件引物設計參照文獻(表1),PCR反應體系(50μL)參照文獻:10×緩沖液5μL(含15mmol/LMgCl2),10mmol/μLdNTP4μL,10pmol/μL引物1μL,模板DNA1.0μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL,ddH2O補足50μL。PCR擴增條件見表2。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。1.5凝膠電泳測定dll利用已獲得的特異性擴增片段均為相應類群的DNA16SrDNAV3組擴增片段產(chǎn)物,用相應的微衛(wèi)星引物(“GC夾”的339f和539r)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。參照文獻,使用Bio-RadDcode進行DGGE凝膠電泳。8%的聚丙烯酰胺膠上進行分離,變性劑梯度范圍為20%～60%(100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。電泳在恒溫60℃下1×TAE緩沖液中進行,電壓150V,12h。電泳結(jié)束后進行SYBRgreenI(100×)染色,用UVI成像系統(tǒng)檢測照相。將DGGE圖譜上的差異條帶和共性條帶分別回收,從凝膠上小心切下DGGE條帶,放入1.5mL滅菌離心管中,加入10μL無菌水,在4℃中暗處放置12h。用相應的微衛(wèi)星引物(去掉“GC夾”的339f和539r)進行二次PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。1.6瓊脂糖凝膠電泳割膠的提取、純度與懸浮液的連接和試驗序列1.7指紋圖譜聚類分析盲腸微生物菌群的數(shù)據(jù)分析使用分析軟件BioNumerics3.0(AppliedMaths,Sint-Martens-Latem,Belgium)對PCR-DGGE指紋圖譜進行條帶計數(shù),用Dice方法計算相似性指數(shù)Cs,用UPGMA(unweightedpairgroupmeanaverage)進行聚類分析。2結(jié)果與分析2.1srdna3區(qū)基因的聚類分析盲腸內(nèi)容物的菌群結(jié)構分析表明,Lactobacillus、Bacteroides特異引物擴增中24個樣品中均得到16SrDNAV3區(qū)基因片段,但Bifidobacterium擴增中末獲得16SrDNAV3區(qū)基因片段,Clostridium擴增中20、40周齡蛋雞和4、6周齡肉雞發(fā)育遲緩群以及1、2、8周齡正常肉雞群共7個樣品中獲得16SrDNAV3區(qū)基因片段,利用上述已得到片段16SrDNAV3區(qū)基因進行PCR-DGGE指紋圖譜和聚類分析。圖1為Lactobacillus分析結(jié)果,從分析結(jié)果中可知,盡管2個截然不同品種均有一些共性條帶,但發(fā)育正常雞群盲腸內(nèi)容物間細菌相似性均高于遲緩雞群;同一品種不同周齡和發(fā)育正常、遲緩雞群間指紋圖譜平均條帶數(shù)差異顯著(P<0.05)。兩品種幼雛期細菌種類均最豐富,分別為14～18和9～14條,育成期分別為11～15和9～14條,產(chǎn)蛋期(育肥)細菌種類比較少,分別為7～11和7～12條。圖2中可知,Bacteroides屬在兩品種均具有較多共性條帶,發(fā)育正常與遲緩雞群間盲腸內(nèi)容物細菌的相似性較為相近;蛋雞和肉雞在不同周齡指紋圖譜的平均條帶數(shù)差異均不顯著(P>0.05),但發(fā)育正常和遲緩雞群間平均條帶數(shù)差異顯(P<0.05)。圖3中可知,表示為Clostridium屬在發(fā)育正常肉雞群盲腸內(nèi)容物細菌相似性低于遲緩雞群,另外發(fā)育正常蛋雞群盲腸內(nèi)容物間細菌相似性高于遲緩雞群,20、40周齡間蛋雞平均條帶數(shù)差異不顯著(P>0.05),但不同周齡以及發(fā)育正常和遲緩肉雞群間平均條帶數(shù)差異顯著(P<0.05)。正常蛋雞產(chǎn)蛋期細菌種類最豐富,電泳條帶分別為12和14條;而育雛期和育肥期正常肉雞群,電泳條帶數(shù)分別為17～19和8條,生長期遲緩雞群,電泳條帶數(shù)11～24條。2.2bacterityes屬菌群相似性指數(shù)由圖4可知,兩品種發(fā)育正常和遲緩雞群間盲腸內(nèi)容物細菌組成不同,即Lactobacillus屬菌群相似性指數(shù)在蛋雞育雛、育成期和產(chǎn)蛋期分別為65.13%～67.50%、54.17%～64.17%和36.67%～43.56%;而肉雞育雛、生長期和育肥期分別為50.48%～53.09%、42.22%～47.79%和55.00%～56.25%。結(jié)果表明蛋雞產(chǎn)蛋期的盲腸細菌影響最大,育雛期影響最小;而肉雞生長期受盲腸內(nèi)容物細菌影響最大,育肥期影響最小。Bacteroides屬菌群相似性指數(shù)在蛋雞育雛、育成期和產(chǎn)蛋期分別為41.05%～54.41%、48.68%～49.78%和55.56%～56.45%;而肉雞育雛、生長期和育肥期分別為32.75%～48.68%、55.73%～56.86%和52.78%～60.27%。結(jié)果表明,蛋雞6周齡的盲腸細菌影響最大,產(chǎn)蛋期影響最小;而肉雞育雛期的盲腸細菌影響最大,8周齡影響最小。Clostridium屬菌群相似性指數(shù)在蛋雞產(chǎn)蛋期為42.86%～50.00%均高于40%,而肉雞育雛和生長期分別為26.32%～29.41%和20.83%～28.76%均低于30%。2.3微生物同源性分析圖1～3中箭頭所指的指紋圖譜中分別割膠回收測序結(jié)果見表3。Lactobacillus屬在產(chǎn)蛋期發(fā)育正常、遲緩蛋雞群均大量定居Lactobacillusagilis;而育雛和育成期大量定居Lactobacillusaviaries、Unculturedbacterium(第8條帶)。UnculturedWeissellasp、Lactobacillusanimalis在2個品種發(fā)育正常、遲緩雞群均大量存在。另外,20、40周齡遲緩蛋雞群和1、2、8周齡正常和4、6周齡遲緩肉雞群中均定居Unculturedbacterium(第12條帶)。Clostridium屬在2個品種發(fā)育正常、遲緩雞群均大量定居Unculturedbacterium(第3條帶);其中蛋雞中定居Unculturedproteoba-cterium(第1條帶),而肉雞群定居Unculturedbacterium(第9條帶);正常肉雞群中大量定居Shigellasonnei(第5條帶),而2個品種遲緩雞群均缺乏此類菌種。Bacteroides屬測序結(jié)果中,兩品種發(fā)育正常、遲緩雞群均大量定居Bacteroidesacidifaciens、Unculturedbacterium。在45個測序結(jié)果中,與GenBank數(shù)據(jù)庫中微生物的同源性絕大多數(shù)都大于98%,有的同源性甚至達到了100%。但是Lactobacillus屬條帶8和14與已鑒定物的相似性僅為93%和90%,而與之親緣關系最近的已鑒定的微生物的同源性僅為90%和84%;條帶2和17與已鑒定的菌中相似性僅為95%和94%,而同源性僅為91%和89%。Bacteroides屬條帶7、9、13、14與數(shù)據(jù)庫中與之同源性最高的不可培養(yǎng)微生物相最近的已鑒定微生物同源性僅為94%、90%、94%和91%,而同源性僅為90%、85%、91%和87%;條帶10和12與已鑒定的菌中相似性僅為92%和91%,而同源性僅為86%、83%。Clostridium屬條帶1與數(shù)據(jù)庫中與之同源性最高的不可培養(yǎng)微生物相最近的已鑒定微生物同源性僅為92%,而同源性僅為86%。3討論3.1宿主因素的影響家禽的生長發(fā)育受遺傳、營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理和疾病等因素的影響,許多疾病會導致飼料利用效率下降,使之正常發(fā)育受阻。腸道微生物可通過影響?zhàn)B分的利用和胃腸道系統(tǒng)的發(fā)育來影響宿主的營養(yǎng)、健康和生長性能。依賴于腸道微生物菌群的組成和活性,會對宿主的健康和生長產(chǎn)生積極或消極的影響。對人類、豬和雞等的研究結(jié)果均證實不同個體腸道菌群指紋圖譜有差異,即使是飼養(yǎng)于相同環(huán)境,飼喂相同飼料,相互接觸的同齡肉雞,都會表現(xiàn)出不同的帶譜,說明宿主因素對腸道菌群的組成影響很大。本試驗結(jié)果也證明不同宿主、不同周齡發(fā)育正常雞群對盲腸細菌的影響存在差異。Lactobacillus、Clostridium特異引物PCR-DGGE指紋圖譜和聚類結(jié)果說明,不同宿主間均具有一些共性條帶存在,但發(fā)育正常雞群盲腸內(nèi)容物間細菌的相似性均高于遲緩雞群。而Bacteroides指紋圖譜和聚類結(jié)果,兩品種具有較多的共性條帶,正常雞群盲腸內(nèi)容物間細菌的相似性與遲緩雞群比較相近,其原因尚不清楚,有待于研究。3.2腸道菌群的年齡和周齡效應光岡知足等對盲腸內(nèi)的正常菌群和優(yōu)勢菌群進行過研究。研究證明,正常情況下,成年雞腸道內(nèi)正常菌群是處于生態(tài)平衡狀況,腸道內(nèi)各菌類間也有穩(wěn)定的比例關系,這種生態(tài)平衡能抑制外界病原菌的入侵。新生雛雞4日齡后卵黃抗體逐漸消失,腸內(nèi)細菌群尚未形成穩(wěn)定的區(qū)系、可能是造成9～21日齡雛雞消化道疾病高發(fā)期的原因。因而,盡早確立腸道優(yōu)勢菌群的優(yōu)勢地位,建立平衡的腸道菌群,是預防雛雞消化道疾病的重要條件。本試驗中蛋雞和肉雞不同飼養(yǎng)階段對盲腸細菌群落的影響均存在年齡(周齡)效應。Lactobacillus屬菌群在蛋雞產(chǎn)蛋期對盲腸細菌的影響最大,育雛期影響最小;而肉雞的生長期對盲腸細菌的影響最大,育肥期影響最小。Bacteroides屬菌群在蛋雞6周齡對盲腸細菌的影響最大,產(chǎn)蛋期影響最小;而肉雞的育雛期對腸道細菌的影響最大,8周齡影響最小。Clostridium屬菌群在商品蛋雞的產(chǎn)蛋期均高于40%,而肉雞的育雛和生長期均低于30%。3.3腸道菌群的多樣性LeyR等有研究證明宿主基因型可影響腸道主要正常菌群,宿主因素決定細菌在不同個體中的定植能力,腸內(nèi)正常菌群平衡是相對的。飼料種類、抗菌藥物、疾病、氣候變化以及日齡等因素,均可影響菌群數(shù)量和種類的變動,研究比較雛雞、育成雞和成年雞腸道后段菌群變化,發(fā)現(xiàn)雛雞隨日齡增長雙歧桿菌與大腸桿菌明顯增加,腸球菌和厭氧