葡甘聚糖-纖維蛋白-殼聚糖共混膜的制備及性能

葡甘聚糖-纖維蛋白-殼聚糖共混膜的制備及性能

1葡甘聚糖與膠原蛋白共混法葡甘聚糖（kgm）是甘薯粉中的一種儲備糖。這是由葡萄糖和甘露糖通過-1和4糖苷鍵連接的高分子葡萄糖。具有良好的補水、果皮、成膜和凝膠，以及特定的生物活性、促進傷口愈合、止血和緩解藥物的功能。然而，在近中性條件下，僅含有葡萄糖的異囊甘酸膜的抗水性能力較低。共混是改善高分子材料性能的有效方法。已有將葡甘聚糖與殼聚糖共混制膜用作可生物降解包裝材料的報道,但迄今未見有用葡甘聚糖共混膜作生物材料的報道。膠原蛋白獨特的纖維狀結構及其良好的生物相容性和低抗原性使之在生物材料領域具有廣泛用途,但純膠原蛋白作生物材料存在著力學性能與抗水性均差等缺點。葡甘聚糖與膠原蛋白共混,膠原蛋白的力學性能雖能得到有效改善,但對其抗水性影響較小;殼聚糖-膠原蛋白共混膜抗水性雖較好,但濕態(tài)力學性能差,為了提高其機械強度,滿足生物醫(yī)用材料使用要求,必須加入戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián),戊二醛不僅有細胞毒性,且易引起組織鈣化。本文利用溶液共混法將葡甘聚糖與膠原蛋白及殼聚糖三者同時共混,以期改善幾種材料及二元共混膜的理化性能,達到材料生理功能的協(xié)同增效,拓寬葡甘聚糖共混膜的應用領域。并表征了共混膜的結構形貌,測定了其物理性能,研究了其細胞相容性。2實驗部分2.1殼聚糖膜的制備葡甘聚糖(成都協(xié)力公司)用文獻的方法純化,含量>98%,粘均分子量為220KD;殼聚糖,臺州復大海洋生物實業(yè)公司,脫乙酰度≥92%,粘均分子量為5×105;鮮牛皮脫脂后利用生物酶技術提取膠原蛋白,常量凱氏定氮法測得膠原蛋白含量>99%,凝膠過濾法測得其分子量分布為185～242KD。分別配制2%殼聚糖溶液(含2%HAc),1%葡甘聚糖水溶液。將兩種溶液與適宜濃度的膠原蛋白溶液按一定比例于45℃熱水浴中充分混合,減壓脫泡后倒入成膜模具中,真空干燥成膜。然后用適宜濃度的NaOH溶液處理,再用蒸餾水反復洗滌、晾干。固定葡甘聚糖與殼聚糖的質(zhì)量比為X1時,按共混膜中葡甘聚糖百分含量為20、33.4、50,將膜分別標記為KCCS-1、KCCS-2、KCCS-3,葡甘聚糖與殼聚糖的質(zhì)量比為X2,葡甘聚糖含量為40%時,共混膜標記為KCCS-4;葡甘聚糖和殼聚糖的質(zhì)量比為X3,葡甘聚糖含量為45%時,標記為KCCS-5;X1、X2和X3的關系為X2>X3>X1。殼聚糖膜、葡甘聚糖-膠原蛋白和殼聚糖-膠原蛋白二元共混膜分別標記為CS、KGM-C和CS-C(兩者質(zhì)量之比均為1∶1)。用同樣方法制得的混合液,經(jīng)脫泡、凍干后用一定濃度的NaOH溶液處理,蒸餾水反復洗滌至中性后,再凍干制得共混海綿,與共混膜KCCS-5組成比例完全相同的共混海綿標記為KCCS-5A。2.2x射線衍射分析三種純聚合物及其共混膜的FT-IR光譜用NicoletMX-1E型(美國)傅立葉變換紅外光譜儀薄膜掃描分析;其衍射譜圖由X’PrtPro型(Philips,Netherlands)X射線衍射儀記錄,電壓40KV,電流45mA,掃描角度5°～50°,掃描速度8°/min。用液氮冷脆斷裂共混膜,真空噴金后用JSM-5900LV掃描電鏡觀察其截面形貌并拍照。將共混膜固定在723分光光度計比色皿的外表面上(不可皺折),在可見區(qū)內(nèi)測定其透光率(膜厚均為100μm),分析其透光性。共混膜的抗張強度及斷裂伸長率按照國家標準GB4456-84進行測試,其吸水率、吸附性和滲透性分別按文獻和的方法測定。2.3細胞-材料物理性片觀察將血管內(nèi)皮細胞分別種植于底部平鋪有經(jīng)預處理的膜KCCS-5和海綿KCCS-5A的96孔板中,種植密度為3×103個/孔,將培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。取培養(yǎng)一周的細胞-材料復合物,固定、脫水后,經(jīng)透明、浸蠟和包埋后切片,染色,封片。用倒置相差顯微鏡觀察,照相。以聚苯乙烯培養(yǎng)板為對照組,即直接接種細胞到孔板中,空白組以200μl完全培養(yǎng)基代替細胞懸液接種細胞,分別于接種1、2、4、8d后用MTT法測細胞在材料上的增殖。3結果與討論3.1混合膜的結構性能3.1.1殼聚糖的吸收峰比較三種純聚合物及其它們的二、三元共混膜的紅外譜圖1可知,三者共混后其譜圖主要發(fā)生了以下變化,三元共混膜中膠原蛋白的酰胺I帶(1650cm-1)、酰胺II帶(1533.2cm-1)和III帶(1241.0cm-1)均發(fā)生了不同程度的紅移,而二元膜中膠原蛋白的酰胺III帶卻是藍移,表明三者共混氫鍵作用較強;三元膜中葡甘聚糖在1730.8、1305.6、756.0cm-1處的吸收峰均消失了,前者的消失表明共混可能脫除了葡甘聚糖分子中的乙?；?后兩個峰消失表明共混使羥基等彎曲振動有較大變化;三元膜在1650cm-1和1541cm-1附近的吸收峰強度隨膠原蛋白比例的降低(KCCS-1～KCCS-3)而減弱,且除膠原蛋白含量較高的KCCS-1外,其它幾種三元膜在這兩處的吸收峰強度均弱于3400～3300cm-1附近的吸收,而膠原蛋白占同樣比例的二元膜在這兩處的吸收峰卻是整個譜圖中最強的,二元膜的吸收峰更接近于純聚合物吸收峰的簡單疊加,三元膜的吸收峰位置和強度與純聚合物比較變化更大,譜圖基本無簡單疊加的痕跡;幾種三元膜中,殼聚糖在1255.51cm-1處的羥基彎曲振動峰均消失了,而二元膜CS-C中該峰僅當明膠含量增至一定程度時才會消失;在三元膜中,殼聚糖與結晶有關的峰1080.26cm-1和663.29cm-1均發(fā)生了較大變化,前者由單峰分裂成了雙峰,且明顯紅移了,后者消失了。上述事實充分說明三種聚合物共混,分子之間發(fā)生了強烈的相互作用,X射線衍射圖譜可進一步證實這一事實。3.1.2殼聚糖與純聚合物膜的晶體結構殼聚糖和膠原蛋白都為低結晶性高分子,殼聚糖分別在10.5°、15°、20.5°處有3個主要結晶峰,本實驗所提取的膠原蛋白在2θ6.86°處有衍射峰。若葡甘聚糖與膠原蛋白及殼聚糖沒有相互作用或相互作用很弱,共混膜中則有各自的結晶區(qū)和無定形區(qū),衍射譜圖將是各組分按共混比例的簡單疊加。由圖2可知:三元膜的衍射譜圖與純聚合物比較均發(fā)生了較大變化;KCCS-2、KCCS-3和KCCS-5的衍射圖中所有的衍射峰都消失了,既找不到屬于膠原蛋白在2θ6.86°的衍射峰,也找不到殼聚糖在2θ10.5°、15.4°和20.1°的衍射峰,而在膠原含量較高的三元膜KCCS-1的衍射曲線上也只能找到膠原蛋白在2θ6.86°的一個極小衍射峰,該峰相對高度遠低于單一聚合物膜和二元膜KGM-C、CS-C、KGM-CS)。不同膜的結晶度大小順序為CS>Collagen>KCCS-1>KCCS-2,KCCS-3,KCCS-5,KGM。上述結果表明:由于無定形高分子葡甘聚糖的加入,使殼聚糖和膠原蛋白的分子排列和構象發(fā)生了明顯變化,無定形區(qū)面積迅速增大,結晶度顯著下降。三者共混,因組分間兩兩相互作用,較二組分共混有更強烈的分子間相互作用,這種作用“擾亂了”膠原蛋白和殼聚糖原有的晶形結構,使三組分共混體系衍射峰顯著減弱、甚至完全消失。3.1.3共混膜的基礎從共混膜截面掃描電鏡圖(圖略)可看出,三元共混膜KCCS具有均勻、光滑的截面形貌,這表明:葡甘聚糖、膠原蛋白和殼聚糖在共混膜中具有良好的相容性。透光率也是判斷共混高分子相容性好壞的輔助手段。若共混膜中高分子相容性較差,則在兩相界面上光的散射或反射將使膜的透光率很低。制膜過程發(fā)現(xiàn)不同共混比例的KCCS膜外觀均是透明的,在可見光區(qū)內(nèi)測定透光率表明,當葡甘聚糖與殼聚糖的質(zhì)量比一定時,KCCS膜的透光率隨膠原蛋白含量的增大而增高(圖略),當膠原蛋白含量一定時,共混膜的透光率隨葡甘聚糖與殼聚糖的質(zhì)量比增加而增高(圖略),但即使葡甘聚糖/殼聚糖質(zhì)量比為1∶1的KCCS膜,在可見區(qū)內(nèi)的最大透光率也高于85%,說明共混膜中膠原蛋白與葡甘聚糖及殼聚糖有良好的相容性。3.2混合膜的理理能3.2.1金屬薄膜中kccs膜的吸水率測定表明(圖略),幾種共混比例不同的KCCS膜的濕態(tài)抗張強度和斷裂伸長率均明顯高于二元膜CS-C、KGM-C和3種單一聚合物膜,它顯示三組分共混分子間作用力顯著增強了。與CS-C膜相似,KCCS膜的斷裂伸長率隨膠原蛋白含量的增加而逐漸降低,其抗張強度先隨膠原含量的增加而增加,當膠原含量為40%時達最大值,之后隨膠原含量的增加而降低;膠原含量一定的KCCS膜,其抗張強度和斷裂伸長率均先隨葡甘聚糖/殼聚糖質(zhì)量比的增加而增加,當質(zhì)量比為1/1時達最大值,之后隨葡甘聚糖/殼聚糖質(zhì)量比的增加而逐漸減少。吸水率測定(圖略)表明:與二元膜CS-C比較,三元共混膜KCCS吸水率略高,但與二元膜KGM-C、膠原膜和葡甘聚糖膜比較大大降低了,該膜在水中存放數(shù)日幾乎無溶解損失。三者共混明顯改善了單一聚合物膜和二元膜KGM-C的吸水性能。與二元膜CS-C相似,KCCS膜的吸水率隨著膠原蛋白含量的增加或葡甘聚糖與殼聚糖質(zhì)量比的增加而增加。3.2.2白的吸附作用表1表明:不同共混比例的三元膜KCCS均對水蒸汽有一定滲透作用,對牛血清蛋白有一定吸附作用,對生命代謝需要的一些小分子物質(zhì)葡萄糖、色氨酸、NaCl有一定滲透作用。三元膜KCCS的透水汽性、滲透性和吸附性較二元膜CS-C均有所降低,這可能是因為三者共混組分間作用力更強,膜的結構致密程度更高等緣故。3.3kccs膜對內(nèi)皮細胞生長的作用培養(yǎng)1周的VEC-共混海綿和膜復合物的切片照片如圖3所示。從細胞組織學和細胞增殖兩方面考察了葡甘聚糖含量為45%的共混膜KCCS-5的內(nèi)皮細胞相容性。由圖3清晰可見內(nèi)皮細胞在共混海綿和膜上的黏附、生長情況,大量被染色成蘭色的細胞聚集在一起已連接成片狀的蘭色覆蓋層(切面圖為邊緣的蘭色線),共混海綿的孔隙處生長的細胞較多,有不少地方已堆積生長形成多層細胞膜片,這一結果與多孔表面有促進內(nèi)皮細胞生長的作用的報道相符。圖4表明與對照組聚苯乙烯培養(yǎng)板比較,共混海綿KCCS-5A和共混膜KCCS-5有顯著促進內(nèi)皮細胞生長的作用。細胞組織學和細胞增殖實驗結果均顯示,膠原蛋白-葡甘聚糖-殼聚糖(KCCS)共混膜具有良好的細胞相容性,在組織工程領域可作為潛在的細胞支架材料。綜上所述,膠原蛋白、葡甘聚糖和殼聚糖三種天然高分子材料具有良好的相容性,膜中三種高分子之間存在著靜電引力、