microrna檢測方法的研究進展

microrna檢測方法的研究進展

微型鈉是一種非編碼的小型鈉，由22.23個果糖苷組成。miRNA通常來源于一個大小約為1000bp的長鏈RNA初始轉錄產物(Pri-miRNA),Pri-miRNA分子在細胞核中經(jīng)過雙鏈RNA特異性RNaseⅢ-Drosha的作用下形成70~100nt的具有莖環(huán)結構的RNA分子(Pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportin-5的作用下轉運至胞質中,被另一個雙鏈RNA特異性RNaseⅢ-Dicer識別,被進一步切割成長約22nt的小分子RNA,即成熟的miRNA。成熟的miRNA在RNA誘導沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)引導下與互補mRNA完全或不完全配對,降解靶mRNA或阻遏其轉錄后翻譯。已證明,miRNA能夠調控多種生理學和病理學的過程,如細胞分化、細胞增殖和腫瘤形成。目前已經(jīng)鑒定出幾百個人類miRNAs,并且發(fā)現(xiàn)它們的序列高度保守;再加上通過計算方法分析推測出的miRNAs,其數(shù)量已在1000以上,但目前仍然很難估計人類和其它哺乳類動物中到底有多少miRNAs。據(jù)推測1個miRNA有幾百個靶基因,這就意味著miRNA調控著一半以上的人類蛋白的編碼基因。最近,miRNA對腫瘤的影響逐漸受到重視。毋庸置疑,在對miRNA進行研究之前需要首先對其進行檢測鑒定,但由于miRNAs序列很短、家族成員序列類似且存在多種成熟形式,對其進行檢測甚至定量均是一種挑戰(zhàn)。那么如何檢測miRNAs呢,本綜述綜合目前的研究現(xiàn)狀,介紹幾種檢測miRNAs的方法。1胞基因表達的一般方法RNA印跡即Northernblot是最經(jīng)典的檢測真核生物RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法,可以從大量的RNA樣本中同時獲得這些信息,這是其它實驗方法所無法比擬的。Northernblot是研究真核細胞基因表達的基本方法,自1977年Alwine等報道以后,1979年就成了分子生物學基本操作方法的一部分。以后,雖做過多次變動和改進,但基本步驟沒有改變。主要包括:①完整的RNA的分離;②根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行分離;③將RNA轉移到固相支持物上,在轉移過程中,要保持RNA在凝膠中的相對分布;④將RNA固定到固體支持物上;⑤固相RNA與探針分子雜交;⑥除去非特異結合到固相支持物上的探針分子;⑦對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。Northernblot是檢測miRNAs的標準方法,并常用來評價其它的miRNAs檢測方法的可靠性。RNA雜交的缺點是低通量,并且在檢測稀有miRNAs時靈敏度不夠。2實時rt-pcr方法檢測mrna實時PCR(RealtimePCR,RT-PCR)有時也稱為動力學PCR,用于基因表達的定量和用DNA陳列技術檢測證實基因的差異表達。實時PCR可用已經(jīng)商品化的熒光檢測PCR儀同時進行擴增特異性核酸序列和測定其濃度,不必在PCR擴增反應過程中抽取樣品進行檢測。熒光檢測PCR儀可對于整個PCR過程中擴增序列的累積速率繪制動態(tài)變化圖。在反應混合液中靶序列的起始濃度越大,要求獲得擴增產物的特定產量的PCR循環(huán)數(shù)越少。因此,靶序列的起始濃度能夠用要求獲得擴增產物的一種特定閾值的PCR循環(huán)數(shù)(CT)來表達。以CT為橫坐標,以一套標準DNA分子產量的起始拷貝數(shù)的以10為底的對數(shù)值為縱坐標作半對數(shù)圖,呈一條直線。一種未知樣品的靶序列可以通過對照這種標準曲線的內推法定量。Bandres等報道用realtimePCR檢測腫瘤組織與非瘤組織中miRNAs表達,發(fā)現(xiàn)兩者間的表達量存在差異。在realtimePCR的基礎上,Lao等報道通過區(qū)分RT引物和合成第二條鏈的引物,可以用多元的RT-PCR擴增很少量的樣本中的miRNAs并分別定量各個miRNA。該方法提高了反應的特異性,并且可以把所有的miRNAs納入單個的多元RT-PCR反應體系中。實時PCR最大的缺點是價格昂貴,不僅購買整套的機器系統(tǒng)價格昂貴,其維持和運行費用也相當可觀,普通實驗室難以開展此項目,使其使用受限。到目前為止,RT-PCR和Northerblot聯(lián)合使用,是定量檢測miRNAs的經(jīng)典方法。3mirna檢測Liu等用含有245個人類及鼠基因組的探針的微芯片(Microchip)大量篩選miRNA,miRNAmicroarray可以檢測組織特異的miRNA,并且實驗結果可重復率高。這種微芯片不僅可以檢測miRNA的類型,還可以對其進行定量。它可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達;通過設計適當?shù)墓押塑账崽结?同時檢測成熟的miRNA及其前體分子;另外需要樣本量小。通過Northernblot和realtimePCR可以印證miRNAmicroarray的結果。miRNAmicroarray可以用于高通量的篩選miRNA,并且可以用于臨床病例的篩選。4raki在病毒基因組分析中的應用Peter等報道了一種名為基于RNA引物陣列的Klenow酶(RNA-primed,array-basedKlenowemzyme,RAKE)的分析方法。該方法是在miRNAmicroarray的基礎上,利用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段,使miRNA與固定的DNA探針雜交。研究發(fā)現(xiàn)RAKE可以敏感特異地檢測miRNA,適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。不僅如此,Peter等還發(fā)現(xiàn)可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出miRNA并對其進行分析,這為從存檔的標本中分析miRNA開啟了希望之門。另外,RAKE還有望用于病毒基因組的分析。根據(jù)Peter等的報道,RAKE在特異性上甚至優(yōu)于Northernblot和其它的microarray基礎上的分析平臺。5x-analytemolpe檢測技術液相芯片(Liquichip)是Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術。液相芯片體系由許多不同的小球體為主要基質構成,每種小球體上固定有不同的探針分子,為了區(qū)分不同的探針,每一種用于標記探針的球形基質都帶有一個獨特的色彩編號,將這些小球體懸浮于一個液相體系中,就構成了一個液相芯片系統(tǒng)。利用這個系統(tǒng),可以對同一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析,這種檢測技術被稱為xMAP(Flexiblemulti-analyteprofiling)技術。由于分子雜交是在懸浮溶液中進行,檢測速度極快,其設計理念亦同樣體現(xiàn)了計算機芯片的并行處理和高密度集成、高通量的精髓,所以冠以“液相芯片”之稱,又稱多功能懸浮點陣(Multi-analytesuspensionarray,MASA)。液相芯片既可以用來診斷蛋白質變化亦可以分析核酸豐度,實驗者既可以接受已有的分析方案,亦可以自行設計實驗方法或使用成套試劑盒,其除具有一般的固相基因芯片的功能,如核苷酸測序、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、基因作圖等,還體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征,應用面非常廣泛。6roarra探針Wang等報道了另一種新的高效檢測miRNA的方法,該方法無需擴增或區(qū)分大小即可檢測數(shù)量低于毫克的總RNA。這種方法的特點是無序列偏移,原位合成的DNA微陣列(DNAmicroarray)探針在序列和大小上均選擇性的與成熟的miRNA匹配,所需樣本量小而產量高。雜交的條件保證大部分的miRNAs都能均衡結合且有較高的雜交產量(25%以上)。此方法操作簡單,靈敏度高(小于0.05amol),可檢測范圍廣(0.2amol~2fmol),并且可對miRNA進行定量檢測。以上微芯片或者微陣列技術所具有的共同特征是可高通量檢測miRNA,并可同時定量miRNA;所需樣本量小;但這些技術的突出弱點就是信息質量的穩(wěn)定性差。那么對于這些高通量的檢測技術,其信息量大是否就意味著質量高呢,目前尚無定論。7mirna的定量檢測David等報道了一種基于擴增技術的小靶點定量PCR(Small-targetquantitativePCR,SQPCR),可以對miRNA進行定量檢測。該技術部分源于T4DNA連接酶辨別錯配的功能。在該技術中,逆轉錄和連接反應共同把分析檢測中的序列特征靶向區(qū)分miRNAs家族成員的區(qū)域,即miRNAs的中心和3′末端區(qū)域。SQPCR由前后兩個酶促反應組成,而每個酶促反應都廣泛應用于核酸檢測。由于生物化學的繁榮發(fā)展,SQPCR很輕易地就可發(fā)展為用于定量任何序列,從而也適用于高通量地靈敏定量已經(jīng)證實的和推測出的miRNAs。8作為模板的mirnasPadlock探針是線性的DNA探針,其末端序列可與相鄰的兩個靶序列雜交。在合適的條件下,當其與RNA模板匹配時,DNA連接酶將連接padlock探針的末端,因此可快速區(qū)分其與底物是否匹配。作為模板的miRNAs隨后可以作為引物進行滾環(huán)擴增,這樣對線性靶序列進行擴增可大大提高靶序列的量。padlock探針技術不需要特殊的儀器設備,可以對幾個納克總RNA中的miRNA進行檢測和量化,是一項簡單且技術含量較低的方法。9原位雜交檢測最近原位雜交(Insituhybridization)檢測miRNAs逐漸發(fā)展起來,它可以檢測候選miRNAs的短暫表達。在原位雜交的基礎上,新的方法正在出現(xiàn)。如Peter等報道,鎖定核酸基礎上的原位雜交[LockedNucleicAcid(LNA)-basedinsituhybridization(LNA-ISH)]可以與RAKE(R