人波形蛋白重組質(zhì)

人波形蛋白重組質(zhì)粒表達(dá)對(duì)乳腺癌的增殖和侵襲的研究

作者賈永喜學(xué)位碩士指導(dǎo)老師魏于全教授前言細(xì)胞骨架(cytoskeleton)前言中間絲(Intermediatefilamenis，IFs)前言Vimentin（Vim，波形蛋白）前言基于vimentin在癌細(xì)胞中表達(dá)是否為增強(qiáng)癌惡性程度的重要因素，明確波形蛋白對(duì)乳腺細(xì)胞表型的影響及其作用機(jī)制，本研究擬通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建的人vimentin基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，體外檢測表達(dá)重組波形蛋白后對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)思路雙酶切驗(yàn)證vimentin真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Vim。pcDNA3.1-Vim轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒表達(dá)MTS細(xì)胞增殖試驗(yàn)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)材料和方法質(zhì)粒、酶、抗體及主要試劑1）pcDNA3.1-Vim由本實(shí)驗(yàn)室提供、2）TRIZOL?Reagent和Lipofectamine?2000購自Invitrogen公司，3）TakaRaOnStepRNAPCRKit（AMV）購自寶生物工程（大連）有限公司，4)MTS細(xì)胞增殖測定試劑盒CellTiter96?AQueousOneSolutionCellProliferationAssay購自Promega公司，5)質(zhì)粒小抽試劑盒GenElute?PlasmidMiniprepKit購自Sigma公司，6)限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自Fermentas公司，DNAmarker:購自MBIFermentas公司材料和方法7)DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit購自Biobisic公司，8)G418Sulfate購自Stratagene公司，9)波形蛋白一抗MonoclonalMouseAnti-VimentinCloneVim3B4（M7020）和熒光標(biāo)記二抗RabbitAnti-Mouse（F0313）均購自DAKO公司，體外侵襲實(shí)驗(yàn)BDBioCoatTMGrowthFactorReducedMATRIGELTMInvasionChamber購自BDBiosciences公司。10)大腸桿菌XLI一Blue:本實(shí)驗(yàn)室保種，購自Clonieeh公司11)DMEM、砂Ml1640和胎牛血清(FCS):購自GibicoBRL公司12)RNaseA和蛋白酶K:購自TaKaRa公司 方法驗(yàn)證vimentin真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Vim。將得到的pcDNA3.1-Vim用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳后鑒定重組子。方法按照以下配制20ul反應(yīng)體系，置37℃孵育5h:試劑體系pcDNA3.1-Vim10ul10xBuffer(yellow)4ulBamHⅠ1ulEcoRⅠ1ulddH2O4ul方法pcDNA3.1-Vim轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞用10％小牛血清的DMEM常規(guī)培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，按每孔105細(xì)胞數(shù)500μl培養(yǎng)基細(xì)胞懸液接種24孔板，次日參照Lipofectamine2000試劑說明書按pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）各0.8μl、脂質(zhì)體2μl分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。方法G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后48h，換800μg/mlG418選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞對(duì)照組于篩選10天全部死亡，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）的細(xì)胞篩選3周后，將G418濃度維持為400μg/ml培養(yǎng)。建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MCF-7-pcDNA3.1(+)和MCF-7-pcDNA3.1-Vim分別命名為MCF-7-p和MCF-7-pV方法RT-PCR分別收集約106細(xì)胞數(shù)MCF-7-pV和MCF-7-p及未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞，依照Trizol試劑說明提取總RNA，用克隆Vimentin基因的引物，同時(shí)在相同反應(yīng)體系中加入β-Actin（1128bp）引物作為內(nèi)參，按TakaRa試劑盒OnStepRNAPCRKit（AMV）一步法RT-PCR，檢測三種細(xì)胞內(nèi)Vimentin基因的表達(dá)情況方法流式細(xì)胞術(shù)分別收集約105細(xì)胞數(shù)MCF-7-pV和MCF-7-p以及未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞，4％多聚甲醛固定，0.1％皂素細(xì)胞膜打孔，用小鼠抗人單克隆一抗Vimentin3B4和兔抗小鼠熒光標(biāo)記二抗免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強(qiáng)度方法MTS細(xì)胞增殖試驗(yàn)分別收集用0.25％胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV細(xì)胞，10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，嚴(yán)格控制稀釋細(xì)胞密度均為5×104/ml，每個(gè)孔加入細(xì)胞懸液100μl，每種細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔接種96孔板，三種細(xì)胞和一個(gè)陰性對(duì)照（僅加等量培養(yǎng)基無細(xì)胞的6個(gè)孔）共為4個(gè)組，置37℃、5％CO2增濕孵箱培養(yǎng)。第二天開始觀察細(xì)胞生長狀況，至接種后72h，細(xì)胞融合度到達(dá)90％左右，按照Promega公司CellTiter96?AQueousOneSolutionCellProliferationAssay說明書直接在每孔中加入該試劑20μl，置上述培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h后酶標(biāo)儀490nm波長讀取吸光度并記錄。方法細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)按照BDBiosciences公司BDBioCoatTMGrowthFactorReducedMATRIGELTMInvasionChamber說明書，取9個(gè)小室分三組置24孔板內(nèi)，每個(gè)小室內(nèi)加入500μl37℃無血清培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)水化2h。分別收集用0.25％胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，嚴(yán)格控制稀釋細(xì)胞密度均為5×104/ml，每個(gè)小室內(nèi)加入細(xì)胞懸液500μl，每種細(xì)胞三個(gè)小室為一組，懸掛小室的9個(gè)孔內(nèi)都加入750μl以0.1％牛血清白蛋白（BSA）作為化學(xué)趨化劑的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2增濕孵箱培養(yǎng)24h。反復(fù)用細(xì)小棉簽輕輕擦拭每個(gè)小室內(nèi)底部并更換生理鹽水沖洗后，95％乙醇固定，HE染色，切薄膜置載玻片，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞。結(jié)果pcDNA3.1-Vim質(zhì)粒的鑒定用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，取酶切產(chǎn)物和重組質(zhì)粒5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示酶切后得到與目的基因同樣大小的1.4Kb片段（圖1）。此重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank的人vimentincDNAORF堿基序列完全吻合。圖1限制性核酸內(nèi)切酶消化鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Vim

Figure1IdentificationoftherecombinantplasmidPGEM-T-Vimbyrestrictionendonucleasesdigestion

M:DNAMarker;1.pcDNA3.1-VimdigestedbyBamHⅠ/EcoRⅠMCF-7-pV細(xì)胞RNA水平表達(dá)vimentin分別取MCF-7-pV和MCF-7-p以及未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞RT-PCR產(chǎn)物5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示MCF-7-pV高表達(dá)vimentin而兩對(duì)照均為低表達(dá)（圖2）。圖2RT-PCR檢測vimentin在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)

Figure2RT-PCRanalysisofvimentinexpressioninMCF-7cells.Thelevelofβ-Actin（1.1Kb）expressionservedascontrol

M:DNAMarker;1:MCF-7-pV;2:MCF-7-p;3:MCF-7流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)，重復(fù)3次，結(jié)果用ｘ±ｓ表示，經(jīng)t檢驗(yàn)（Ｐ＜0.05），熒光強(qiáng)度表明MCF-7-pV細(xì)胞明顯高于MCF-7-p和未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞，MCF-7-pV細(xì)胞表達(dá)了重組波形蛋白（表1）流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果MCF-7-pv3.9±0.5MCF-7-p2.2±0.4MCF2.3±0.3NegativeControl2.0±0.3表1流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞vimentin抗體染色的熒光強(qiáng)度Table1Flowcytometrydeterminationofstablytransfectedandnon-transfectedMCF-7cellsusingAnti-vimentinstaining細(xì)胞增殖能力細(xì)胞的增殖潛能是通過MTS檢測每孔相同細(xì)胞數(shù)5×103的三種細(xì)胞培養(yǎng)72h后490nm波長的吸光率的大小來確定的。在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下每種細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔，取平均值并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，表示為：ｘ±ｓ，經(jīng)t檢驗(yàn)（Ｐ＜0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MCF-7-pV細(xì)胞人工表達(dá)波形蛋白后降低了其增殖能力（表2）。表2MTS細(xì)胞增殖試驗(yàn)測定細(xì)胞490nm波長的吸光率

Table2Theabsorbanceat490nmmeasuredusingtheCellTiter96?AQueousOneSolutionAssay.

吸光率（490nm）MCF-7-pv1.44±0.11MCF-7-p1.52±0.12MCF1.54±0.13NegativeControl0.32±0.07細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞的侵襲潛能用每個(gè)小室相同細(xì)胞數(shù)2.5×104的三種細(xì)胞培養(yǎng)24h后穿過被覆類似人體上皮組織基底膜成分的基質(zhì)膠濾膜（密布8μm微孔）的細(xì)胞數(shù)來判定。每種細(xì)胞三個(gè)小室，在400倍光學(xué)顯微鏡下，每個(gè)小室濾膜計(jì)數(shù)兩個(gè)視野，每種細(xì)胞有6個(gè)值，取平均細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，表示為：ｘ±ｓ，經(jīng)t檢驗(yàn)（Ｐ＜0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重組波形蛋白在MCF-7-pV細(xì)胞表達(dá)降低了其侵襲能力（表3）。細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)MCF-7-pv17±4MCF-7-p44±6MCF40±7表3體外侵襲試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)每個(gè)高倍（×400）視野下平均的侵襲細(xì)胞