熒光原位雜交fish技術在染色體定位中的應用

熒光原位雜交fish技術在染色體定位中的應用

熒光原位異交技術（fish）是一種非輻射分子遺傳技術。該技術將細胞學方法與分子雜交技術相結合,利用熒光標記的DNA片段為探針,與分裂中期的染色體DNA雜交,在染色體上顯示與探針同源的DNA片段的位置,從而將這段DNA序列定位在染色體上。熒光原位雜交技術已經廣泛地應用于染色體鑒定、遺傳病診斷、異常染色體檢測及基因定位等的研究。與哺乳動物相比,熒光原位雜交技術在魚類基因定位研究中的應用受到兩方面的限制,一是魚類的染色體較小,某些種類的染色體數(shù)目龐大(銀鯽Carassiusauratusgibelio156條),不易獲得清晰、分散好的染色體分裂相,而魚類染色體的顯帶技術也相對落后;二是除部分模式生物外,多數(shù)魚類的遺傳數(shù)據(jù)積累較少,沒有達到基因定位以及繪制染色體圖譜的水平。盡管如此,近年來,隨著染色體顯帶技術的進步,熒光原位雜交技術正逐步應用于魚類,尤其是斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)、羅非魚(Oreochromisniloticus)、大西洋鮭(Salmosalar)等模式生物的遺傳學研究中,所用的探針主要包括來源于BAC等大片段文庫的單拷貝基因、編碼核糖體RNA(rDNA)和組蛋白的多拷貝基因、衛(wèi)星家族或隨機重復的DNA克隆序列等,用于研究特定基因定位、性染色體鑒定及雜合子鑒別等遺傳學問題,取得了一定的成績,少數(shù)種類已繪制了與遺傳連鎖圖譜相對應的完整染色體圖譜。本文簡要介紹了熒光原位雜交技術的基本原理及實驗流程,綜述了此技術在魚類基因定位研究中的應用現(xiàn)狀,展望了此技術的應用前景。1原聚光刻技術的基本原理和實驗過程1.1熒光原位雜交熒光原位雜交(FISH)技術的基本原理是用生物素或毛地黃毒苷等熒光染料標記DNA片段作為探針,然后將其直接原位雜交到染色體或DNA纖維上,再利用偶聯(lián)有熒光素分子的單克隆抗體與探針的特異結合,通過觀察熒光雜交信號的有無或強弱,實現(xiàn)DNA序列在染色體上的定位、定性和相對定量分析。熒光原位雜交基本原理如圖1所示。熒光原位雜交技術主要具有以下優(yōu)點:(1)用熒光素取代了放射性同位素標記探針,安全性高;(2)探針穩(wěn)定性高,實驗周期短;(3)借助多次免疫化學反應,增強雜交信號,提高了靈敏度;(4)分辨率較高;(5)能夠利用不同的熒光素分子標記不同的探針,在一張切片上實現(xiàn)幾種DNA探針的定位,獲得不同DNA探針在染色體上的相對位置和順序,對研究基因組和功能基因的定位具有重要意義。1.2熒光原位雜交的處理常規(guī)FISH技術的實驗流程主要包括染色體標本的制備、探針的標記及純化、染色體雜交前處理、探針與染色體的雜交、洗脫及免疫熒光放大和顯微觀察及圖像分析處理幾個步驟。影響熒光原位雜交效果的因素有很多,如染色體標本的質量、探針的長度和染色體的變性時間等。因此,應根據(jù)探針和靶DNA的最適退火條件優(yōu)化變性溫度和時間,以獲得最高的雜交效率。1.2.1染色樣品的制備目前魚類染色體標本制備的方法主要包括血細胞培養(yǎng)法、腎細胞培養(yǎng)法和活體注射腎細胞培養(yǎng)法等。1.2.2異源異倍體探針探針的類型主要包括:(1)染色體特異性重復DNA序列探針。如rRNA基因、端粒重復序列、著絲粒重復序列等。這些探針主要定位于染色體的著絲粒和端粒,用于快速檢測染色體單體和多倍體。此類探針保守性較強,已廣泛應用于斑馬魚、虹鱒、銀鯽等魚類的研究。(2)總基因組DNA探針。用一個物種的基因組DNA作為探針,與另一個物種的染色體進行原位雜交,可用于分析異源多倍體基因組組成、起源及親緣關系。已經用此類探針鑒別出了虹鱒、銀鯽等魚類雜合體中分別來源于父本和母本的染色體。(3)單拷貝序列探針,來源于大片段基因組文庫,如BAC、YAC、粘粒文庫中分離的含有特定序列的探針,用于鑒定染色體的易位或畸變、定位特異基因等。近幾年,此類探針在魚類的定位研究中呈現(xiàn)快速上升趨勢,尤其是研究基礎較好的斑馬魚、鮭鱒已經利用來源于BAC文庫的大片段繪制了細胞遺傳學圖譜,并定位了部分功能基因。根據(jù)標記和檢測特點,將探針的標記方法分為直接法和間接法。直接標記法是將熒光物直接標記到核苷酸上,雜交后可直接檢測到;而間接法是先在探針上接半抗原如生物素、地高辛等,鏡檢之前再用與半抗原特異結合的蛋白質進行標記檢出。間接標記法主要有隨機引物法、缺口平移法、PCR擴增、RNA轉錄法等。所使用的標記物大多為在激發(fā)光下能發(fā)熒光的物質,其中常用的標記物有異硫氰酸熒光素(FITC)(綠熒光)、羧基氨甲基香豆素醋酸酯(AMCA)(藍熒光)和羅丹明衍生物(TRITC)(紅熒光)等。1.3提高分辨率技術FISH技術主要向兩個方面發(fā)展,一是探針方面,通過采用不同的探針,衍生出許多新技術,如多色熒光原位雜交(Muticolor-FISH)、比較基因組雜交(CGH)、以BACs或YACs克隆片段為探針的BAC-FISH、以正常染色體為探針的染色體涂色(ChromosomePainting)、反向染色體涂色(ReverseChromosomePainting)等;二是努力提高分辨率技術。通過發(fā)展DNA纖維作為靶目標,將其分辨率由1Mb提高到1kb。2探針的研究現(xiàn)狀隨著魚類遺傳學數(shù)據(jù)的積累,熒光原位雜交技術在魚類基因定位研究中得到了較為廣泛的應用,涉及的探針主要有來源于BAC等大片段文庫的單拷貝序列探針、rDNA和組蛋白等多拷貝基因探針、著絲粒和端粒等重復序列以及其他一些重復序列。2.1基因或標記的發(fā)掘近幾年,大部分模式魚類及重要經濟魚類構建了BACs等大片段基因組文庫,為單拷貝基因或標記的發(fā)掘提供了便利條件。目前,將含有感興趣的標記、基因或序列的大片段DNA克隆作為探針,利用熒光原位雜交的方法將其定位到染色體上的研究在魚類中呈現(xiàn)快速上升趨勢,研究熱點主要集中在性別連鎖標記的定位、細胞遺傳學作圖、功能基因定位等方面。2.1.1半干重異基因分子rt1基因的擴增鑒于大部分魚類不具有異型的性染色體,因此,通過尋找性別連鎖的基因或標記,用熒光原位雜交技術進行定位,鑒定出性染色體,可以實現(xiàn)魚類的早期性別鑒定。此方面的研究主要集中在青鳉、羅非魚、鮭鱒等物種。Matsuda等(1998)將分離出的一個含有性別連鎖標記的大片段克隆(pHO5.110)作為探針,鑒別出青鳉的性染色體,進一步鑒別出DMY基因是O.latipes和O.curvinotus的Y染色體特異基因。Nanda等(2002)在青鳉中篩選出含有DMRT1基因的BAC克隆,原位雜交結果顯示,DMRT1基因除特異雜交到Y染色體上以外,還在一對常染色體上出現(xiàn)較弱的雜交信號,表明此基因序列在基因組中出現(xiàn)了復制。但是,DMY基因并沒有在其他相近種發(fā)現(xiàn),Takehana等在相近種O.dancena、O.hubbsi、O.minutillus以及O.javanicus等開展了一系列比較研究,分離出了各種特異的性別連鎖標記及fosmid克隆探針,鑒別出了性染色體,結果多數(shù)種類性染色體為同源染色體,僅在O.hubbsi和O.javanicus的W染色體上發(fā)現(xiàn)異型染色質,其中O.hubbsi的W染色體在形態(tài)上大于Z染色體。連鎖分析和熒光原位雜交結果表明,青鳉相近種的性染色體及性別決定機制差異很大,預示著性染色體可能來源于不同的常染色體,可能具有不同的性別決定基因。Phillip等(2001)在不同種鮭鱒魚的性染色體中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。Ezaz等(2004)分離出尼羅羅非魚性別連鎖的AFLP標記,并利用含有此標記的BAC克隆,將此標記定位在1#染色體的長臂。Ocalewicz等進一步檢測了2個含有性別連鎖標記的BAC克隆在羅非魚1#染色體上的排列,發(fā)現(xiàn)Dmo(dmrt4)和OniY227均被雜交到1#染色體的長臂,但是dmrt4的信號位置更接近著絲粒。Mota-Velasco等用已發(fā)表相近種的BAC文庫探針,結合SATA、端粒等重復序列,鑒定出Oreochromiskarongae1#~5#染色體的特異位點。在鮭鱒魚中,Artieri等(2006)把大西洋鮭含有性別連鎖的微衛(wèi)星SEX用BAC克隆做探針雜交到2#染色體長臂的末端,證實其性染色體是一對大型的等臂染色體。Li等將此探針定位到斑鱒(Salmotrutta)一個小型的近端著絲粒染色體的短臂末端,證實斑鱒的性染色體是不同于大西洋鮭的同型染色體。2.1.2建立細胞圖譜細胞遺傳學圖譜是將遺傳連鎖圖譜上的基因或標記與其在染色體的具體位置聯(lián)系起來,既能反映基因或標記之間在染色體上的真實距離,又能顯示其與染色體的細胞學結構間確切的位置關系。長期以來,遺傳連鎖圖譜中使用的基因或標記由于序列較短,無法用熒光原位雜交的方法實現(xiàn)其在染色體上的特異定位,而利用含有目標基因或標記的大片段克隆作為探針就可以提高定位的特異性,確定該標記在染色體上的具體位置,建立細胞遺傳學圖譜,整合策略如圖2所示。目前,完成細胞遺傳學作圖的魚類較少,Phillips等在斑馬魚BAC文庫中找到了與連鎖圖對應的基因或標記,用BAC克隆作為探針,用熒光原位雜交的方法將斑馬魚25個連鎖群定位在染色體上,其中最大的連鎖群定位在最大的染色體上。Freeman等用多色熒光原位雜交的方法構建了斑馬魚染色體定位的BAC探針庫,找到了每對染色體靠近著絲粒和端粒的特異性探針,在575個BAC克隆探針的定位結果中,有544個在染色體上獲得了唯一的陽性信號,僅31個BAC探針獲得了比較復雜的信號,表現(xiàn)出較強的探針特異性。Phillips等(2006)用BAC克隆作為探針,構建了虹鱒的細胞遺傳學圖譜,在連鎖群和染色體之間建立了線性關系,其中80%的BAC探針獲得了單一的染色體定位結果,并且連鎖群的大小與染色體的大小之間表現(xiàn)出一定的相關性。2009年,該課題組用同樣的方法排列了大西洋鮭的染色體圖譜,為鮭鱒功能基因的定位提供了有力的工具。2.1.3bac克隆測序檢測利用大片段克隆探針定位功能基因在研究基礎較好的鮭鱒魚類開展的較多。Phillips等(2003)利用熒光原位雜交的方法,將虹鱒MHC基因定位到4個不同的染色體上,揭示了MHCI型基因復制事件的發(fā)生,并利用BAC克隆序列中的微衛(wèi)星、RFLP等標記,分別與4個連鎖群建立了對應關系;Rozman等(2008)將轉鐵蛋白基因定位在斑鱒的2個中等大小的近端著絲粒染色體上。Lai等獲得了3個大西洋鮭含有脂肪酸蛋白基因(fabp2aI、fabp2aII和fabp2b)的克隆,利用FISH的方法將此3個基因分別定位在不同的染色體上。Quinn等分離了大西洋鮭含有α、β型血紅素基因的BAC克隆,利用克隆中含有的微衛(wèi)星序列將2個血紅素基因定位在第4和第11連鎖群上,FISH定位的結果顯示,它們分別位于第6和第3號染色體上,與細胞遺傳學圖譜相符。2.2多因素基因的定位研究在魚類中,研究最多的多拷貝基因是編碼核糖體RNA(rDNAs)和組蛋白的基因(表1)。2.2.1無轉錄活性成分檢測rDNAs是具有重要功能的保守重復序列,成簇分布于一對或多對染色體上,通常參與核仁的形成,故稱之為核仁組織區(qū)(NOR)。18S和28S的rDNA作為探針已經在斑馬魚、鮭、鱒、羅非魚、骨甲鯰科(Loricariidae)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等模式魚類和經濟魚類中定位成功,5SrDNA也在部分魚類中得到了定位。通過熒光原位雜交技術將rDNA在染色體上進行物理定位,可以驗證銀染和CMA3的染色結果。Pendas等(1993)在對鮭魚中發(fā)現(xiàn),Ag-NORs位點與FISH信號并不完全重疊,Ag-NORs位點只局限于次縊痕位置,而FISH信號卻散布在整個染色體臂上。Gornung等(1997)、Pendas等(1993)以rDNA為探針分別對斑馬魚和鱒進行FISH分析,發(fā)現(xiàn)了無轉錄活性(transcriptionlyinactive)的NORs位點。Pendas等的雙標記FISH研究表明,鮭的5SrD-NA、l8SrDNA和28SrDNA位于同一條染色體上,而虹鱒的5SrDNA位于一條與主要rDNA簇相臨的常染色體以及X染色體上?？梢?FISH技術用于rDNA位點的檢測比銀染和CMA3染色更靈敏。rDNA的定位可以用來研究種屬間的進化關系,闡明染色體的結構變異等重要的遺傳學問題。Zhu等用5SrDNA做探針,在銀鯽的3個同源的染色體上檢測到陽性信號,在鯽2個同源染色體上有信號,證實了銀鯽的三倍體起源,而日本三倍體銀鯽(Carassiusauratuslangsdorfi)僅在1對同源染色體上檢測到陽性信號。Caputo等用28SrDNA在意大利棕鱒的幾個品系中檢測出非活性核仁組織區(qū)的多樣性;Adriatic(Ad)和Mediterranean(Me)兩個家系的28SrDNA數(shù)量多于Atlantic(At)家系和Marmoratus(Ma)家系,而這幾個家系的5SrDNA位點則沒有差異。Moran等(1996)在5SrDNA定位中發(fā)現(xiàn)其與性染色體連鎖,在雌性虹鱒中發(fā)現(xiàn)4個陽性熒光信號,而在雄性中只有3個。Kavalco等(2005)在骨甲鯰科的4種魚中的18SrDNA定位中發(fā)現(xiàn)2個位于一對同源染色體上的信號,只有Hypostomusaffinis在5個位點上發(fā)現(xiàn)信號。Martins等(2000;2002)發(fā)現(xiàn)羅非魚5SrDNA中具有兩種亞型,FISH定位在3個染色體對上,其中1個位點為I型,兩個位點為II型;而18SrDNA具有3個位點,且與5SrDNA呈非線性關系。2.2.2組蛋白基因分類Pendas等利用FISH技術定位了鮭、鱒、虹鱒的組蛋白基因簇,結果發(fā)現(xiàn),組蛋白基因在這幾種魚中是重復的單拷貝,只有一個位點。2.3重復序列的組成結構生物體內其他的DNA重復序列主要分為三種類型:(1)保守型串聯(lián)重復序列。一般是構成結構基因的序列,包括著絲粒和端粒上的重復序列;(2)非結構基因相關的串聯(lián)重復序列。如微衛(wèi)星序列;(3)散在的轉位因子序列。在魚類中定位較多的是著絲粒重復序列和端粒序列。2.3.1at與at的比較FISH技術研究為著絲粒結構提供了重要手段,研究著絲粒結構主要是對著絲粒重復序列進行分析,包括重復元件,如α、β和傳統(tǒng)衛(wèi)星DNA。Phillip等研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚著絲粒重復序列有兩個序列亞系,分別富含AT和GC,而富含AT的重復序列進一步分為兩個亞群,這兩個亞群之間只有10%的差異。染色體定位結果顯示,AT的重復序列位于所有染色體對的著絲粒位置,而GC重復序列在過半數(shù)的染色體對中處于臂內;AT的兩個亞型表現(xiàn)也存在差異。Garrido-Ramos等(1994)在金頭鯛(Sparusaurata)中通過EcoRI消化得到了186bp的單體DNA,進一步將其定位在鯛屬7種魚的著絲粒部位。Capriglione等(1994)通過類似的方法將從南極冰魚中分離出的一個1000bp的單體DNA序列定位于著絲粒區(qū)。2.3.2晶圓體上的端粒序列應用FISH技術定位端粒重復序列(TTAGGG)n,可直接觀察到染色體的端粒。Abuim等(1996)通過FISH技術定位了4種鮭科魚類的端粒序列,發(fā)現(xiàn)在鮭(S.salar)的長染色體的間質異染色質區(qū)有內端粒序列(Interstitialtelomericsequence,ITS),進一步證實了在鮭的核型進化過程中,長的近端著絲粒染色體和亞中部著絲粒染色體形成的核型進化機制為線性融合;而在虹鱒中,雜交信號出現(xiàn)在整個核仁組織區(qū),表明端粒序列散布在該染色體區(qū),而在大西洋鮭中沒有檢測到ITS。Chew等(2002)對羅非魚端粒序列的定位結果顯示,1#染色體存在2個ITS,證實了核型中最大的1#染色體由三個染色體融合形成,也能夠解釋了在羅非魚由硬骨魚祖先進化至今的過程中,染色體數(shù)目由2n=48減少到現(xiàn)今的2n=44的現(xiàn)象。Mota-Velasco等在相近種O.karongae的1#染色體發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象外,在其他3個染色體對(2#、3#,及4#)中還分別觀察到1個內端粒序列位點。Fujiwara等(2007)在牙鲆中也觀察到部分染色體(2~6個)中出現(xiàn)內端粒信號,但是,最大的1#染色體并沒有觀察到內端粒序列。2.3.3羅非魚染色體的雜交分析及拓展Vi觡as等(2004)將一個高度重復的HpaIDNA序列(富含AT,約63%,與其它著絲粒衛(wèi)星序列相似)通過熒光原位雜交將其定位到三個近端部著絲粒染色體的著絲粒區(qū)。該結果在其它鮭科魚類中也得到了驗證。Oliveira等(1999)在尼羅羅非魚中對麗魚長散布元件2(Cichlidlonginterspersednucleotideelement2,CiLINE2)進行了FISH定位,結果顯示CiLINE2以小簇形式散布在尼羅羅非魚的所有染色體上,其中高度集中在染色體末端,在1#染色體的長臂大量富集。Oliveira等(1998)將兩個衛(wèi)星DNA,SATA(237bp)和SATB(1900bp)作為探針,通過FISH定位到羅非魚中,結果發(fā)現(xiàn)在不同的實驗條件下,SATA雜交信號強度有所不同,而SATB的雜交信號則呈現(xiàn)出很大的差異。Mota-Velasco等將SATA重復序列定位到了O.karongae所有染色體的著絲粒部位,同時還在三個通過線性融合形成的中等大小的染色體對的前著絲粒區(qū)發(fā)現(xiàn)了信號。Perez等(2000)利用tRNAMet作為探針,將其定位到大西洋鮭和棕鱒中,結果顯示tRNAMet線性重復地出現(xiàn)在兩種魚的同一個位點。Martínez等(1999)在大西洋鮭中定位了一個GT重復的微衛(wèi)星序列,在85%的細胞中都有強烈的雜交信號出現(xiàn),位于近端部著絲粒染色體的中部。在青鳉、新月魚、大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)、羅非魚等魚類中分離出了性別特異或性別連鎖的重復DNA序列,并用熒光原位雜交技術鑒定了性別染色體。Iturra等(1997)將一個雄性特異的重復DNA序列定位到虹鱒的Y染色體上,另一個雄性特異的重復DNA序列被定位于大鱗大麻哈魚的一個巨型亞著絲粒染色體短臂的端粒位置。董在杰等(2006)將性別連鎖或相關標記定位于尼羅羅非魚第一對染色體長臂近末端。Nakayama等(1994)在Leporinuselongates中分離出兩個性別特異的重復序列,其中一個同時定位于Z染色體和W染色體上,而另外一個為W染色體特有。Haaf等(1993)在hopliasmalabaricus中得到的一個355bp的DNA序列,包含A、B兩種類型,其中B型主要位于一條性染色體上。3探針的單刑罰材料和技術的應用近幾年,熒光原位雜交技術應用于魚類基因定位方面的研究呈明顯上升趨勢,涉及的物種主要集中在模式魚類及鮭、鱒、羅非魚等少數(shù)養(yǎng)殖魚類,所用的探針從早期的保守性強的基因組特異探針到種群特異性強的來源于大片段基因組文庫的單拷貝基因探針,研究的深度和廣度均有不同程度的增加。但是,大多數(shù)水產動物,尤其是養(yǎng)殖魚類,受限于基因組資源的積累及技術的掌握,利用此項技術開展的研究仍然很少。隨著研究的深入,利用熒光原位雜交技術在養(yǎng)殖魚類中開展基因定位研