黃芩有效成分高效液相色譜圖譜的初步研究

黃芩有效成分高效液相色譜圖譜的初步研究

中藥黃鼠尾是嘴唇科植物的干燥根，具有清熱除濕、清火解毒、冷血安神等功效。而其清熱作用更是使黃芩成為臨床常用的解熱藥物。中國(guó)藥典中,黃芩苷作為黃芩的主要有效成分用于含量測(cè)定以判定藥材的優(yōu)劣。然而,作為道地藥材的熱河黃芩,與其他產(chǎn)地黃芩相比,黃芩苷含量偏低。除黃芩苷外還有哪些成分對(duì)黃芩的作用起到了重要的作用是本研究的工作目的。由于黃芩中化學(xué)成分較多,本課題選擇灰色關(guān)聯(lián)法,對(duì)黃芩的解熱作用與化學(xué)成分進(jìn)行多元分析。1材料表面1.1陰山ph、陰山子片、阿腸溶片一年生河北承德(批號(hào)20071211),遼寧大連(批號(hào)20071213),山西朔州(批號(hào)20071212)3個(gè)產(chǎn)地的黃芩。阿司匹林腸溶片,規(guī)格40mg,北京曙光藥業(yè)責(zé)任有限公司,批號(hào):國(guó)準(zhǔn)H11021614。干酵母,配制酵母懸液——稱取干酵母20g置于乳缽中,逐漸加入蒸餾水磨為均勻的懸液,最后定容為100mL(濃度為20%),此液須于臨用前配制。1.2儀器、檢測(cè)方法電子分析天平:塞多利斯分析天平,BS1248,(上海精密儀器儀表有限公司)。邁克大夫電子體溫計(jì):MT1931(北京天天聯(lián)眾科技有限公司)。低溫高速離心機(jī):H2500R-2(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。GC-911-γ-放射免疫技術(shù)器(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司)。Agilent1100高效液相色譜儀(四元泵、在線脫氣、VWD檢測(cè)器)。1.3試劑及標(biāo)準(zhǔn)體系PBS:北京欣源佳和生物科技有限公司,批號(hào)070830。人白介素1β(IL-1β)放免試劑盒:北京華英生物技術(shù)研究所,批號(hào)20070815。環(huán)磷酸腺苷(CAMP)放免試劑盒:北京華英生物技術(shù)研究所,批號(hào)20070716。精氨酸升壓素(AVP)放免試劑盒:北京華英生物技術(shù)研究所,20070901。乙腈為色譜純(MERCK);純凈水、磷酸,分析純。1.4基礎(chǔ)直直直通道溫度Wistar大鼠,雄性,SPF/VAF級(jí),體重190~210g,基礎(chǔ)直腸溫度37.0~38.5℃。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證編號(hào):SCXK(京)2007-0001。2方法和結(jié)果2.1解熱藥效應(yīng)2.1.1樣品制備山西醇提物,山西水提物,河北醇提物,河北水提物,大連醇提物,大連水提物(由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系提供)。2.1.2平均體溫變化平均體溫變化曲線:將所有大鼠置于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境適應(yīng)3~4d,每日用體溫計(jì)從肛內(nèi)測(cè)體溫2~3次,間隔1h,使其適應(yīng)測(cè)肛溫操作,減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體溫波動(dòng)對(duì)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日每小時(shí)測(cè)體溫1次,連續(xù)2~3次,選取體溫在37.0~38.5℃之間,體溫變化不超過(guò)0.3℃的動(dòng)物供實(shí)驗(yàn)用。并取平均值為基礎(chǔ)體溫。將合格大鼠隨機(jī)分為9組,每組10只,分別為各地黃芩水提物組(3組)、各地黃芩醇提物組(3組),正常對(duì)照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組。灌胃1h后,各組背部皮下注射20%的酵母混懸液(正常對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水)。然后于造模后0.5、1、2、4、6、8、10、12h各測(cè)大鼠體溫1次,觀察體溫變化情況。以體溫上升高度(Δt)為縱坐標(biāo),測(cè)量時(shí)間為橫坐標(biāo),根據(jù)各測(cè)量點(diǎn)的均數(shù)繪制平均體溫變化曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,第8小時(shí)的測(cè)量值效果最顯著。在灰色關(guān)聯(lián)處理數(shù)據(jù)過(guò)程中,需要對(duì)照熱效果體溫變化原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理,因此本次研究采取了與模型組比較,從而得到8h的比較藥效值。公式如下:(第8小時(shí)的體溫變化值-第8小時(shí)模型組體溫變化值)/第8小時(shí)模型組體溫變化值×100%。結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明河北醇提物的解熱效果與其他提取物相比,效果較好。2.2高效液體層析成像的測(cè)定2.2.1酸相和檢氣系統(tǒng)色譜柱:KromasilC18柱(4.6mm×250mm,10nm,5μm)。流動(dòng)相:A為0.6%磷酸水溶液;B為乙腈。梯度洗脫:0min:80%A,20%B;45min:73%A,27%B;70min:50%A,50%B;80min:20%A,80%B。檢測(cè)波長(zhǎng):274nm;流速:1.0mL/min,進(jìn)樣量10μL,柱溫30℃。2.2.2hplc-ms分析2.1項(xiàng)下3個(gè)產(chǎn)地6種黃芩提取物1mL于10mL容量瓶中,加70%甲醇至刻度,稱重。超聲30min,再稱重并補(bǔ)足質(zhì)量。用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液1mL作為供試品溶液備用。按3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,得HPLC圖譜。結(jié)果見(jiàn)表3。2.2.3吾素保留時(shí)間按3.1的色譜條件下,將黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣,可知保留時(shí)間為31.352min的是黃芩苷,49.74min為漢黃芩苷,60.815min為黃芩素,71.518min為漢黃芩素,見(jiàn)圖1。2.3灰色相關(guān)性分析2.3.1幾何曲線形狀與關(guān)聯(lián)度的關(guān)系灰色關(guān)聯(lián)度分析來(lái)自灰色系統(tǒng)理論。其基本思想是一種相對(duì)性的排序分析,根據(jù)序列曲線幾何形狀的相似程度來(lái)判斷其聯(lián)系是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似關(guān)聯(lián)度越大,反之則越小,由此從所考察的復(fù)雜系統(tǒng)中找出主次因素,為系統(tǒng)綜合決策及提高綜合效益提供信息。也就是說(shuō)兩者在發(fā)展過(guò)程中相對(duì)變化基本一致,則認(rèn)為兩者關(guān)聯(lián)度大,反之,兩者關(guān)聯(lián)度小。設(shè)有n個(gè)中藥樣品,每個(gè)樣品有m項(xiàng)指紋特征量化指標(biāo),這樣構(gòu)成了m個(gè)子序列。以樣品藥效學(xué)指標(biāo)作為母序列,依據(jù)母序列與子序列關(guān)聯(lián)度的大小,可確定諸指紋特征對(duì)藥效貢獻(xiàn)的大小。2.3.2計(jì)算方法2.3.2.選取典型并進(jìn)行計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù):經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母序列記為{Xo(k)},子序列記為{Xi(k)},則母序列{Xo(k)}與子序列{Xi(k)]的關(guān)聯(lián)系數(shù)Loi(k)可由下式計(jì)算:Loi(k)=(Δmin+Δmax)/(Δoi(k)+ρΔmax)式中Loi(k)表示兩比較序列的絕對(duì)差,即Δoi(k)=|Xo(k)–Xi(k)|(1≤i≤m)。Δmin和Δmax分別表示所有比較序列絕對(duì)差中的最小值與最大值。因?yàn)楸容^序列相交,故一般取Δmin=0;ρ稱為分辨系數(shù),其意義是削弱最大絕對(duì)差數(shù)值太大引起的失真,提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性,ρ∈(0,1),本研究選取0.8。關(guān)聯(lián)系數(shù)反映2個(gè)被比較序列的靠近程度。2.3.2.roi與母序列o的關(guān)聯(lián)度關(guān)聯(lián)度按兩比較序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值計(jì)算。公式如下:roi=1/N∑k=1NLoi(k)roi=1/Ν∑k=1ΝLoi(k)roi為子序列i與母序列o的關(guān)聯(lián)度,N為比較序列的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)。2.3.2.指紋特征與療效的關(guān)聯(lián)度分析將m個(gè)子序列對(duì)同一母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列起來(lái),便組成關(guān)聯(lián)序,記為{X},它直接反映各個(gè)子序列對(duì)母序列的“貢獻(xiàn)”的大小。據(jù)此可尋找指紋特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與藥效間的聯(lián)系,結(jié)果見(jiàn)表4。關(guān)聯(lián)結(jié)果表明,對(duì)于解熱作用來(lái)說(shuō),關(guān)聯(lián)度大于0.92的物質(zhì)為:黃芩苷、黃芩素、X16(保留時(shí)間為74.1)。黃芩苷與解熱作用的關(guān)聯(lián)度最大。同時(shí)黃芩素與X16解熱作用的關(guān)聯(lián)度也不容忽視。3不同成分對(duì)熱效應(yīng)的初步確認(rèn)灰關(guān)聯(lián)分析是一種用灰關(guān)聯(lián)度順序來(lái)描述因素間相關(guān)程度的方法,強(qiáng)調(diào)了因素間相關(guān)程度的順序。其“幾何對(duì)應(yīng)”的特點(diǎn)也可使動(dòng)態(tài)指標(biāo)的原始信息得到充分的利用。本研究表明黃芩苷是黃芩解熱作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明,黃芩苷在體內(nèi)可以水解之后生成黃芩素,同時(shí)黃芩素可以在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成黃芩苷。因此,對(duì)于解熱作用來(lái)講,不可單一靠黃芩苷來(lái)表征,也應(yīng)注意到黃芩素及其他黃酮類物質(zhì)對(duì)解熱作用有著不可忽視的貢獻(xiàn)。本研究初步說(shuō)明黃芩苷、黃芩素是黃芩解熱作用的重要