加減清營(yíng)湯對(duì)h

加減清營(yíng)湯對(duì)h

血栓形成性脈管炎（tao）屬于中醫(yī)學(xué)的“脫離性”范疇。這是一種常見(jiàn)的周圍血管疾病。其發(fā)病率位于周圍血管病的第二位置，通常為年輕男性。臨床以加減清營(yíng)湯治療TAO的療效已得到證實(shí),實(shí)驗(yàn)研究亦觀察到該方的作用機(jī)理和改善血液流變狀態(tài)、降低全血黏度和血漿黏度、抑制血小板聚集、改善血液循環(huán)狀態(tài)有關(guān)。為深入探討該方治療TAO的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用H2O2誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為模型,研究加減清營(yíng)湯對(duì)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞活力和NO、t-PA分泌的影響。1養(yǎng)成方和試劑SD雄性大鼠8只,體重(280±20)g,南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304):購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所。加減清營(yíng)湯:在清代溫病學(xué)家吳鞠通的清營(yíng)湯的基礎(chǔ)上,結(jié)合王燦暉教授治療脈管炎的經(jīng)驗(yàn)組合成方,全方由丹參、赤芍、生地、麥冬、連翹、毛冬青等組成,制成100%煎劑(即1mL/1g生藥),藥物由南京中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診部提供,符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2005版)規(guī)定。一氧化氮檢測(cè)試劑盒,碧云天生物技術(shù)研究所;組織型纖溶酶原激活物測(cè)定試劑盒,ADL,USA;RPIM-1640培養(yǎng)粉,GIBCO,USA;小牛血清,杭州四季青;MTT,FLUKA,Switzerland;過(guò)氧化氫,分析純,上海久憶化學(xué)試劑有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1給予劑量蒸餾加減清營(yíng)湯水煎劑給大鼠連續(xù)灌胃3天,每天2次,正常對(duì)照組給予等量蒸餾水。末次給藥后1h(灌藥前禁食不禁水12h),頸動(dòng)脈取血,1000r/min,離心15min,分離血清,56℃,30min滅活,過(guò)濾除菌,-20℃保存。2.2血清培養(yǎng)液的制備將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)以105/cm2的密度接種于96孔板,分為5組,細(xì)胞長(zhǎng)至融合后,除正常組外,其余各組在造模前均用不含血清的培養(yǎng)液處理以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)H2O2損傷的敏感性。實(shí)驗(yàn)分組如下:正常組,含10%小牛血清的培養(yǎng)液;模型組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、不含血清的培養(yǎng)液;血清對(duì)照組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液;加減清營(yíng)湯組:加H2O2(終濃度為380μmol/L)、含10%加減清營(yíng)湯藥物血清的培養(yǎng)液。37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、36h。2.3g/ml培養(yǎng)96孔板每孔加入20μLMTT(5mg/mL),37℃培養(yǎng)4h;之后加入100μLDMSO,震蕩15min,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)定各孔OD值。2.4no含量測(cè)定取各組細(xì)胞上清液50μL,按試劑盒方法檢測(cè)。2.5-p含量的測(cè)量取各組細(xì)胞上清液100μL,按試劑盒方法檢測(cè)。2.6統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,平均值以標(biāo)準(zhǔn)差反映離散水平,兩組之間差異顯著性進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。3結(jié)果3.1不同血清營(yíng)湯組,24hod值比較MTT結(jié)果表明模型組OD值與其它各組相比呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01);加減清營(yíng)湯組,24hOD值高于血清對(duì)照組,但P>0.05;36hOD值繼續(xù)高于血清對(duì)照組,且呈極顯著差異(P<0.01),見(jiàn)表1。3.2no和t-pa含量的檢測(cè)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)血瘀證患者常發(fā)生低NO血癥并且TAO患者體內(nèi)的t-PA含量低于正常水平,因此,檢測(cè)NO和t-PA含量對(duì)探討加減清營(yíng)湯的作用機(jī)制具有積極的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組NO和t-PA含量最低,與其它各組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且加減清營(yíng)湯組NO和t-PA含量均最高,見(jiàn)表2。4增強(qiáng)血管內(nèi)的張力和張力近年來(lái)研究認(rèn)為,TAO患者中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓功能明顯紊亂,凋亡的血管內(nèi)皮細(xì)胞和微顆粒進(jìn)入血流而形成血栓。中醫(yī)認(rèn)為血管痙攣、舒縮功能失常是導(dǎo)致TAO發(fā)病的重要因素,同時(shí),在病變過(guò)程中,瘀血阻滯,新血不能運(yùn)行,則脈絡(luò)失于滋養(yǎng),營(yíng)熱燔熾,壅遏脈中,灼傷脈絡(luò),營(yíng)陰耗傷,脈道失于濡潤(rùn),均可導(dǎo)致脈管的調(diào)節(jié)、舒縮功能障礙進(jìn)一步加重。因而擴(kuò)張血管,解除血管痙攣,促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立,改善肢體的血運(yùn),是治療TAO的重要措施。加減清營(yíng)湯的基本功效之一就是活血通脈,方中根據(jù)TAO瘀血、營(yíng)熱、陰傷的病理特征采用丹皮、赤芍、丹參、毛冬青、川牛膝等涼血清營(yíng)而散血,從而使血脈通利、脈管的固攝作用增強(qiáng)、脈管的收縮和舒張功能保持平衡、血液運(yùn)行暢通無(wú)阻。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,加減清營(yíng)湯含藥血清對(duì)H2O2損傷的ECV304細(xì)胞有保護(hù)作用,提示加減清營(yíng)湯可通過(guò)修復(fù)細(xì)胞損傷和維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,實(shí)現(xiàn)其抗血栓形成等功能。NO有極強(qiáng)的舒張血管作用,對(duì)血小板聚集和血栓形成有強(qiáng)烈的抑制作用,還可以穩(wěn)定溶酶體膜、對(duì)抗氧自由基對(duì)血管內(nèi)皮的損傷;血管內(nèi)膜的抗血栓特性與其纖溶能力密切相關(guān),組織型纖溶酶原激活物(t-PA)是纖溶系統(tǒng)中纖溶酶的特異性激活物