分子遺傳學(xué)第三章 DNA的功能

第三章DNA的功能

第一節(jié)轉(zhuǎn)錄TranscriptionDNA一般存在于核內(nèi)，蛋白質(zhì)合成則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，那么DNA是怎樣控制蛋白質(zhì)的合成呢？

一.RNA是中間體：實驗證據(jù)用放射性RNA前體（如尿嘧啶）作標(biāo)記實驗表明，最先合成的放射性RNA是在細(xì)胞核中產(chǎn)生的；然后用非放射性RNA前體作跟蹤實驗，結(jié)果：放射性RNA又流向了細(xì)胞質(zhì)，這提示，在DNA和蛋白質(zhì)之間的遺傳信息傳遞過程中，RNA是一中間物。用非放射性用放射性RNA前體標(biāo)記

示蹤后RNA出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中

RNA前體示蹤遺傳信息的流向——中心法則□如用T2噬菌體感染大腸桿菌，最明顯的變化是RNA的快速合成，而且發(fā)現(xiàn)RNA與T2噬菌體的DNA的核苷酸成份是非常相近的。證明RNA是由DNA合成而來的，然后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)的特定場所指導(dǎo)合成特定的蛋白質(zhì)，因此遺傳信息的流向包括三個步驟。DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄

核RNARNA

質(zhì)轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)錄

□以DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)原則合成一條單鏈RNA，從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過程稱轉(zhuǎn)錄（transcription），RNA合成以5’—3’方向進(jìn)行。

轉(zhuǎn)錄

□不對稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。分子雜交證明，某一基因的RNA只能與其DNA的一條鏈有雜交反應(yīng)，即說明DNA上只有一條鏈可作為模板合成該基因的RNA。5’3’變性分開5’3’+標(biāo)記的RNA

復(fù)性

5’5’5’3’3’3’3’5’模板鏈（或互補(bǔ)鏈）編碼鏈

RNA在一定時間上是由DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄而來的，然而在整個染色體或生活周期的各個時期并不一定由同一條鏈轉(zhuǎn)錄。在一個包含有許多基因的DNA分子中，各個基因的有意義鏈并不總是同一條DNA單鏈。在原核生物中，所有類型的RNA轉(zhuǎn)錄都由同一種聚合酶完成；而在高等真核生物中，有三種不同的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄不同的RNA（核仁內(nèi)的RNA聚合酶催化rRNA，核內(nèi)有二種RNA聚合酶分別催化合成mRNA和tRNA）。

三、轉(zhuǎn)錄的起始（Initiation）

1．啟動子（promoter）：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號的一段序列，它能指導(dǎo)全酶與模板正確地結(jié)合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。大腸桿菌啟動子序列分三個部位：R位點：RNA聚合酶識別位點；B位點：結(jié)合部位；I位點：轉(zhuǎn)錄起始部位。

－10區(qū)－35區(qū)

pribnowbox

TGTTGACA…15－17bp－…TATAAT…5－8bp…起始點）+1——2．RNA聚合酶

E.coliRNA聚合酶500kd，由α、β、β’、ω、σ五種不同的亞基組成，全酶：α2ββ’ωσ。核心酶：α2ββ’ω；σ因子本身無催化功能，當(dāng)它與核心酶結(jié)合時可使RNA聚合酶識別啟動子序列，并能特異性地在這些部位上形成穩(wěn)定的復(fù)合體。3．如何起始（Initiation），首先Sigma因子和核心酶結(jié)合成全酶，全酶與DNA上識別部位結(jié)合后移至轉(zhuǎn)錄起始部位，并使DNA雙鏈打開，在全酶的催化下，使底物rNTPs結(jié)合于DNA分子的起始位上，并形成第一個磷酸二酯鏈。σ亞基的釋放表示起始的終結(jié)。四、轉(zhuǎn)錄延伸（Elongation）RNA合成以5’→3’方向延伸，在此過程中，DNA、酶、RNA始終維持穩(wěn)定的三元復(fù)合物。在延伸中OH總是新的末端。Theearlystagesoftranscriptioninprokaryotes,showing(a)thecomponentsoftheprocess;(b)templatebindingatthe–10siteinvolvingthesigmasubunitofRNApolymeraseandsubsequentinitationofRNAsynthesis;and(c)chainelongation,afterthesigmasubunithasdissociatedfromthetranscriptioncomplexandtheenzymemovesalongtheDNAtemplate.12-8五、轉(zhuǎn)錄的終止（Termination）RNA聚合物也能識別鏈的終止信號。

1．在某些情況下，識別作用是直接的。終止子（tenminator）：轉(zhuǎn)錄終止的信號，其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。在終止處RNA聚合酶作用停止，新生RNA鏈釋放，2．識別終止信號有時需要某些蛋白質(zhì)因子（rho因子）的作用，rho因子與RNA聚合酶相互作用導(dǎo)致RNA鏈釋放。終止子（terminator）：DNA序列上轉(zhuǎn)錄終止的信號，其作用是在DNA模板的特定位置處終止RNA的合成。DNA上終止子有兩個明顯特征：如下圖（1）鏈內(nèi)具有對稱結(jié)構(gòu)，能使轉(zhuǎn)錄物形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；（2）DNA上有一串A，轉(zhuǎn)錄形成的RNA3’端具有多個U，A－U配對不牢固，使RNA脫落。

UCCUGG·CA·U－25C·G

15－C·GG·CC·GC·G

5’UAAUCCCACAG

·

CAUUUU3’535第二節(jié)轉(zhuǎn)譯translation一、不同組分的RNA分子

E.coli中的RNA分子：

類型占細(xì)胞RNA% S 分子量 n.t.

rRNA80231.2×106

3700

160.55×1061700

53.6×1041700

tRNA1542.5×10475

mRNA 5異質(zhì)性

核糖體ribosomes

是由核糖體蛋白和核糖體RNA（rRNA）組成的復(fù)合體。在電鏡下，一個核糖體象一個墨滴。有關(guān)核糖體的精細(xì)的功能仍然是目前眾多研究中的重要課題，rRNA分子如何與蛋白質(zhì)相結(jié)合以及其功能目前仍然不清楚。Acomparisonofthecomponentsintheprokaryoticandeukaryoticribosome13-1

二、蛋白質(zhì)合成作為化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)合成，主要有以下幾個過程：

合成酶1．a(chǎn)a1+tRNA1+GTP

aa1－tRNA1+GDP

裝載型（charged）2．在核糖體上，裝載型tRNA的能量轉(zhuǎn)為連接aa的肽鍵能。

aa1-tRNA1+aa2-tRNA2

核糖體上肽基轉(zhuǎn)移酶

aa1-aa2-tRNA2

+tRNA1（釋放）較小的多肽

二、蛋白質(zhì)合成

3．新的氨基酸通過肽鍵接到生長的鏈上：

aa3-tRNA3+aa1-aa2-tRNA2aa1-aa2-aa3-tRNA3

+tRNA2（釋放）

較大的多肽4．上述過程繼續(xù)進(jìn)行直至aan（最后一個aa連接上),整個過程還需mRNA，核糖體，一些蛋白質(zhì)因子，酶和無機(jī)離子。

三、蛋白質(zhì)合成的特異性1.識別mRNA上編碼特異性氨基酸的密碼子是tRNA還是氨基酸?半胱氨酸--tRNA半丙氨酸—tRNA半

用雜合性的丙氨酸—tRNA半合成的蛋白在原先預(yù)期是半胱氨酸的位置上都是丙氨酸。結(jié)論：氨基酸在語言上有錯誤，識別密碼子是由tRNA的特異性決定的。鎳化氫2．反密碼子（anticodon）：tRNA上能識別一個mRNA密碼子的位置，這個位置上的堿基與密碼子的堿基是互補(bǔ)的。3．tRNA的一般結(jié)構(gòu)和功能區(qū)由于tRNA上反密碼子環(huán)能識別mRNA相應(yīng)的密碼子，因此在遺傳信息的轉(zhuǎn)譯中起十分重要的作用。4．tRNA來自何處？一個基因一條多肽的理論并不是完全正確的，有些基因編碼蛋白，而另一些基因（如rRNA或tRNA基因）是編碼并合成RNA作為終產(chǎn)物。

Holley’stwo-domensionalcloverleafmodeloftransferRNA.13-3Athree-dimensionalmodeloftransferRNA.13-4四、核糖體功能和蛋白質(zhì)合成

1.轉(zhuǎn)譯組分

2.轉(zhuǎn)譯起始1.在起始因子的作用下,mRNA與小亞基結(jié)合2.在P位點上起始tRNA與mRNA的密碼子相結(jié)合,起始因子IF3釋放。3.大亞基結(jié)合到復(fù)合體上，起始因子IF1和IF2釋放；延長因子與tRNA結(jié)合利于進(jìn)入A位點Elongationofthegrowingpolypeptidechainduringtranslation.

3.延長Terminationoftheprocessoftranslation.

13-84.終止Polyribosomesvisualizedundertheelectronmicroscope.a.兔子網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白mRNA的轉(zhuǎn)譯b.搖蚊巨唾液腺細(xì)胞中mRNA的轉(zhuǎn)譯□在原核生物中，轉(zhuǎn)譯并不等到mRNA合成完成之后開始，一部分mRNA合成后，核糖體能立即附著到mRNA上起動轉(zhuǎn)譯，而在真核生物中，轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯有時間和空間上的分開。第三節(jié)遺傳密碼TheGeneticCode

假如核苷酸對是密碼中的字母，字母的不同組合會形成代表不同氨基酸的文字，要解決的問題是：1.密碼是重疊還是非重疊的?2.由多少個字母組成一個文字?即密碼子3.哪一種特定的密碼子或哪幾種密碼子代表各自特定的氨基酸?

一、遺傳密碼的非重疊性(nonoverlapping)

1．1961年，用遺傳分析證明，遺傳密碼是非重疊的實驗證據(jù)：對TMV由亞硝酸誘發(fā)的突變的蛋白作分析表明，在某一蛋白質(zhì)區(qū)段中一次只有一個氨基酸的變化。如果是重疊密碼子，那么一個堿基的變化將會使蛋白質(zhì)中鄰近位置上多達(dá)三個氨基酸的變化。

ATT

GCT

CAG

CTTGAC

ATT

TTGTGCGCTCTCOverlappingcode

aa1

aa2aa3aa4aa512345

NucleicacidNonoverlappingcode

aa1aa2aa3aa4aa5AminoacidCodonCodonAminoacid

?非重疊密碼子和重疊密碼子的區(qū)別

2．在某一特定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯中是以非重疊方式讀碼的，但并不排除用相應(yīng)不同的讀碼框架（readingframes）來編碼不同蛋白質(zhì)的氨基酸的可能性。一種蛋白編碼方式……ATT

GCT

CAG

CTTG……

另一種蛋白解讀時移動一個堿基：

……ATTG

CTC

AGC

TTG……二、密碼中字母的數(shù)目

理論上推測：至少三個核苷酸對組成一個密碼子：43=64種

三、利用抑制基因證明密碼三聯(lián)體性質(zhì)60年代初，Crick等用遺傳學(xué)實驗驗證了密碼子的三聯(lián)體特征：1．原黃素能誘發(fā)T4的rII突變（不能在K上生長），其作用是在DNA鏈中造成單個核苷酸對的插入或缺失：

插A—TATCT

A

GTCTTAGA

T

CAGAATCTGTCTTAGACAGATAGACAA

缺C—G

ATCTGTT?開始由原黃素誘導(dǎo)的突變體稱FCO突變體，F(xiàn)CO再經(jīng)黃原素處理會自發(fā)產(chǎn)生能在E.coliK（λ）上形成野生型噬菌斑的“回復(fù)突變體”（revertants）。對這些突變體作遺傳分析發(fā)現(xiàn)，與真正的野生型不同，其回復(fù)突變的表型是由于在FCO的同一順反子中不同位點上發(fā)生了第二個突變。這種第二個突變抑制了原先FCO突變的表達(dá)

?突變抑制基因（Suppressormutation）：能反作用于或抑制另一突變的效應(yīng)。（1）抑制基因與它被抑制的那個基因的位置不同；（2）可位于同一基因內(nèi)，也可位于不同的基因內(nèi)；（3）不同的抑制基因有不同的功能。

?利用重組可以從原初的正向突變體分離到抑制基因突變體。奇怪的是，發(fā)現(xiàn)該抑制基因自身也是一種rII突變。

rII’(–FCO)rII’rII’’回復(fù)rII’rII’’++rII’rII’’和分離FCO和抑制基因Wildtype?怎樣解釋上述結(jié)果？原黃素誘導(dǎo)的單個核苷酸對的插入或缺失會引起移碼突變（frame-shiitmutation），從而引起大多數(shù)密碼的錯讀，但是在某個地方由于插入和缺失的補(bǔ)償作用，會恢復(fù)合適的讀碼，只在兩個突變位點之間產(chǎn)生一小段錯誤的密碼：（用三字母英文單詞代表密碼子）

THEFATCATATETHEBIGRAT

缺C：THEFAT

ATATETHEBIGRAT

插A：THEFAT

ATA

ATETHEBIGRAT插入恢復(fù)了信息中大多數(shù)密碼的含義，從而抑制了缺失的效應(yīng)大多數(shù)密碼的錯讀大部分恢復(fù)合適的讀碼?假定FCO突變是由于一個核苷酸對的插入，那么第二個突變即抑制基因突變就應(yīng)該是一個缺失，因為只有這樣才能恢復(fù)該基因的讀碼框。假定密碼由三字母組成：野生型：CAT

CAT

CAT

CAT

CAT……

rII’插入A：CAT

ACA

TCA

TCA

TCAT……√××××不正確rII’rII’’缺失A：

CAT

ACA

TCT

CAT

CAT……√××√√正確結(jié)論在抑制性基因型中只有少數(shù)密碼子錯誤，大部分可恢復(fù)原來野生型的密碼子，從而產(chǎn)生近乎正常的酶。因此具有類似野生型表型。這與Crick發(fā)現(xiàn)的抑制基因突變體表型回恢的遺傳事實相符。2．符號突變?如果將FCO突變的插入定為“+”，那么抑制基因突變就可自動地定為“－”，一個突變與它的抑制因子的符號相反，實驗證明：一個“+”不能抑制一個“+”，一個“－”也不能抑制一個“－”，相同符號的兩個突變永遠(yuǎn)不會相互抑制。

?Crick用巧妙的遺傳學(xué)實驗提供了三聯(lián)體密碼學(xué)說的第一個證據(jù)：*構(gòu)成“+++”或“－－－”的三重突變組合共同作用可以恢復(fù)到野生型表型，這一發(fā)現(xiàn)說明：遺傳密碼的單詞是由三個連續(xù)的核苷酸對組成的?；謴?fù)合適的讀碼進(jìn)一步圖解：

CAT

CAT

CAT

CAT

CAT

CAT

CAT……

CAT

ACA

TAT

CAT

CAT

CAT……正?！獭痢痢獭獭?結(jié)論：只有密碼子是三聯(lián)體才會使一個基因內(nèi)的三個插入或三個缺失自動恢復(fù)正確讀碼,才可以恢復(fù)到野生型表型.Deletions

四、遺傳密碼的兼并性（degeneracy）一個氨基酸具有兩個或多個不同的密碼子稱作密碼的兼并性。如果只有20種三聯(lián)密碼有意義，其余44種為無意義，那么大多數(shù)移碼突變將導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的終止。小結(jié)有關(guān)密碼的基本知識：（1） 密碼是非重疊的。（2） 密碼子是三聯(lián)體。（3） 讀碼從一固定的起始點開始一直連續(xù)不斷地讀至編碼序列的末端，移碼突變會改變序列中其余密碼子的排列。（4） 密碼子是兼并的，一個氨基酸不只有一種密碼子。第四節(jié)遺傳密碼的破譯Crackingthecode

遺傳密碼的破譯——確定每種三聯(lián)體的含義，這是過去近四十年來遺傳學(xué)中最重大的突破之一。一、破譯密碼的試驗1．制備單一核苷酸的mRNA。Nurenberg（1961）用大腸桿