第四章 發(fā)酵機制及控制

第四章發(fā)酵機制與代謝控制

自然發(fā)酵，產(chǎn)品大都是微生物自身不能夠再利用的代謝物質(zhì)。通過對環(huán)境的控制，來提高其產(chǎn)量和產(chǎn)率，代謝控制發(fā)酵，產(chǎn)品多為代謝中間物質(zhì)或者要進一步轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。不但需要嚴格的控制環(huán)境，通常還需要對其代謝機制有系統(tǒng)地了解§4-1糖的代謝與調(diào)節(jié)本節(jié)主要介紹糖代謝的幾條代謝途徑，和其調(diào)節(jié)機制，并簡單介紹糖代謝厭氧發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。一、糖代謝的途徑糖代謝的主要途徑有：1、糖的酵解途徑——EMP途徑2、TCA循環(huán)3、HMP途徑（磷酸戊糖途徑）4、ED途徑1、糖的酵解途徑——EMP途徑

其產(chǎn)物是：丙酮酸

丙酮酸有氧氧化生成：乙酰輔酶A

丙酮酸無氧代謝：脫羧，生成乙醛，乙醛還原生成乙醇2、TCA循環(huán)

丙酮酸在有氧的條件下，在丙酮酸氧化脫羧酶系（脫氫酶）的作用下，氧化脫羧生成乙酰輔酶A（CH3-CO-SCoA）進入TCA循環(huán)，徹底氧化成CO2和H2O?？偟姆磻剑?/p>

C6H12O6=6CO2+6H2O+32ATPTCA一圈，即每分子乙酰輔酶A氧化，有：

2.5ATP*3+1.5+1+2.5

總計：2*（2.5ATP*3+1.5+1+2.5）+2.5*2+2=32ATP

將葡萄糖徹底氧化成CO2和H2O，并有29分子的ATP生成

特點：（1）中間代謝產(chǎn)物中有，C7

、C5

、C4

有利于微生物的合成代謝。（2）只有NADP參入氧化脫氫反應，可以產(chǎn)生大量的NADPH

（3）是一條高產(chǎn)能的氧化途徑。反應式：C6H12O6=6CO2+6H2O+29ATP3、HMP途徑（磷酸戊糖途徑）常見的是細菌的ED途徑，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。反應式：

C6H12O6=2丙酮酸+2TP+NADPH+NADH例如：在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長期：EMP/HMP=38%GA合成期：EMP/HMP=26%4、ED途徑

1.糖代謝的能荷調(diào)節(jié)

能荷=[ATP]+1/2[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP]

顯然，能荷在0—1之間糖原←葡萄糖→產(chǎn)生ATP關(guān)鍵酶：G磷酸化酶磷酸果糖激酶（PFK)

異檸檬酸脫氫酶檸檬酸合成酶因此，能荷對糖代謝的調(diào)節(jié)是方向性的。二、糖代謝的調(diào)節(jié)機制2、生物素的調(diào)節(jié)

生物素對糖代謝的調(diào)節(jié)與能荷的調(diào)節(jié)是不同的，后者是對糖代謝流的調(diào)節(jié)，而生物素的主要作用是對糖降解速率的調(diào)節(jié)，通常生物素能夠促進糖的EPM途徑，對TCA循環(huán)也有促進作用，對糖的HMP途徑也有促進作用，但是，對上述三條途徑的促進作用的大小卻不同，對EMP途徑的促進作用較大……。3、磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用三、酵母菌的酒精發(fā)酵生產(chǎn)簡介§4-2酵母菌的甘油發(fā)酵一、行業(yè)簡介

1、應用化工領(lǐng)域：環(huán)氧氯丙烷，改性醇酸樹脂、酚醛樹脂等醫(yī)藥工業(yè)：添加劑，潤滑劑等食品工業(yè)：甜味劑、保濕劑，對風味也有獨特的影響在造紙、皮革、玻璃、化妝品等行業(yè)：約1700多種產(chǎn)品需要。2、生產(chǎn)方法：（1）天然油脂為原料：天然油脂肥皂，廢水回收甘油原煙臺第二化工廠生產(chǎn)軍用甘油，其副產(chǎn)品……（2）以丙烯為原料合成殼牌的氯化法，過乙酸法（3）發(fā)酵法甘油生產(chǎn)：厭氧發(fā)酵、好氧發(fā)酵3、我國發(fā)酵甘油在技術(shù)上與國外主要存在以下差距：

（1）殘?zhí)歉?，…?/p>

（2）規(guī)?；^少，……4、我國甘油市場的構(gòu)成與西方發(fā)達國家相比也有較大的差異：

中國：涂料，49%；醫(yī)藥食品，10%

美國：涂料，10%；醫(yī)藥食品，54%以上二、甘油的厭氧發(fā)酵1、酵母菌代謝合成機制

1,6—二磷酸果糖丙酮酸葡萄糖（磷酸化，葡萄糖激酶）（磷酸果糖激酶）ATPATP3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸NADH磷酸二羥丙酮NAD+NADH乙醛α-磷酸甘油NADH（甘油激酶）乙醇甘油（乙醇脫氫酶）醛縮酶2、亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵酵母菌在酒精發(fā)酵時，如加入亞硫酸氫鈉等鹽類，它能與乙醛起加成作用，生成難溶的結(jié)晶狀亞硫酸納加成物，這樣就使乙醛不能作為受氫體，而迫使磷酸二羥丙酮作為受氫體，在α-磷酸甘油脫氫酶（NAD為輔酶）催化下生成α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成α-甘油。CH2OHOH││C6H12O6+NaHSO3→CHOH+CH3-

C-OSO2Na+CO2↑

││

CH2OH

O

H3、堿法甘油發(fā)酵雙分子歧化反應乙醛+乙醛==乙醇+乙酸則，NADH沒有受體，使得菌體的代謝流轉(zhuǎn)向合成甘油的方向進行，從而生產(chǎn)大量的甘油。

4、厭氧甘油發(fā)酵的能量和轉(zhuǎn)化率的問題：以葡萄糖為原料的甘油的厭氧發(fā)酵，產(chǎn)率不可能突破50%的轉(zhuǎn)化率。

5、厭氧甘油發(fā)酵的缺點：（1）堿性條件、無能量產(chǎn)生，導致菌體死亡率較高，……。（2）轉(zhuǎn)化率較低。三、甘油的好氧發(fā)酵在甘油發(fā)酵過程中通風，以減少酵母細胞的死亡率；另一方面，在適當?shù)难醯拇嬖谙拢湍讣毎梢赃M行有限的有氧代謝，為其自身的生長提供必需的ATP。

這種有限的好氧發(fā)酵，使得丙酮酸進行TCA循環(huán)的同時，也增加了TCA循環(huán)過程中的許多中間性產(chǎn)物，對于甘油的提取帶來了不利的影響?！?-3檸檬酸發(fā)酵機制與代謝調(diào)控一、行業(yè)簡介1.我國的檸檬酸發(fā)酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能。2.盡管采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝，但發(fā)酵周期只有64小時。3.檸檬酸的產(chǎn)酸速度大大地高于國外水平。平均產(chǎn)酸速率是國外的2倍。

葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A(CH3CO-CoA)

CO2固定反應草酰乙酸+

（檸檬酸合成酶）

檸檬酸二、檸檬酸的生物合成途徑用圖示之：特點：順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶的活性喪失或非常微弱三、檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與控制

1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié)研究表明，微生物體內(nèi)的NH4+，可以解除檸檬酸對PFK的這種反饋抑制作用，在較高的NH4+的濃度下，細胞可以大量形成檸檬酸，那么NH4+濃度是如何升高的呢？

Mn2+

缺乏如何會使NH4+濃度升高呢？外源氮源分解產(chǎn)生氨基酸 菌體生長合成蛋白質(zhì)）氨基化合成氨基酸（消耗NH4+）2.順烏頭酸酶活性的控制該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環(huán)，大量生成檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過程中仍需要控制它的活性。由于該酶的活性受到Fe2+的影響，控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度，可以使該酶失活。但是在檸檬酸發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度有要求不能夠低于0.1mg/L，原因目前尚沒有搞清楚。3.能荷調(diào)節(jié)對檸檬酸發(fā)酵的影響側(cè)系呼吸鏈：NAD(P)H經(jīng)過該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒有氧化磷酸化生成ATP，能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標準呼吸鏈。只長菌不產(chǎn)酸：四、檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率

1.無CO2固定反應的產(chǎn)率

192/(180*1.5)==71.1%2.通過CO2固定反應提供C4二羧酸

192/180==106.6%C6H12O6C6H8O7(C沒有增加)

可見，CO2固定反應堆與檸檬酸發(fā)酵的重要性。

在檸檬酸產(chǎn)生菌內(nèi)，存在下列CO2固定反應

1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶以上兩種CO2固定反應所需要的輔酶都是生物素。在檸檬酸發(fā)酵過程中，存在三個控制要點：（1）點：EMP暢通無阻控制Mn2+NH4+濃度升高，解除檸檬酸對PFK的抑制；防止側(cè)系呼吸鏈失活。（2）點：通過CO2固定反應生成C4二羧酸，強化這一反應的方法和意義？…………（生物素、錳離子、鎂離子、罐壓等）（3）點：檸檬酸后述的酶的酶活性喪失或很低：方法：控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度五、檸檬酸產(chǎn)生菌的育種

1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯+2%的瓊脂+0.5%CaCO3

誘變后，涂布，透明圈大的則好，為何？淀粉的水解能力。2.顯色圈大小平板：麥汁培養(yǎng)基+pH值指示劑誘變后，33℃培養(yǎng)3天，顯色圈大的則好。

3.不分解檸檬酸的菌株不利用檸檬酸為碳源進行生長的菌株，說明其TCA循環(huán)中檸檬酸后述的酶的活性較低，或者喪失，這有利于檸檬酸的積累。方法：以檸檬酸為唯一的碳源的培養(yǎng)基上，選擇生長不好的突變株。4.選育不長孢子、少長孢子、遲長孢子的菌株在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會使TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成?！?-4GA的生物合成機制與代謝調(diào)節(jié)一、GA的生物合成途徑二、GA生物合成的內(nèi)在因素三、GA生物合成的最理想途徑與轉(zhuǎn)化率四、生物素在GA發(fā)酵中的作用五、細胞膜通透性的調(diào)節(jié)六、GA發(fā)酵的外在因素七、GA發(fā)酵生產(chǎn)中的異?，F(xiàn)象及其處理一、GA的生物合成途徑（1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH（2）HMP:6－磷酸果糖

3－磷酸甘油酸

NADPH:

－酮戊二酸還原氨基化必需的供氫體。（3）TCA循環(huán):生成谷氨酸前體物質(zhì)－酮戊二酸。（4）CO2固定反應:補充草酰乙酸。（5）乙醛酸循環(huán):使琥鉑酸、延胡索酸和蘋果酸的量得到補充，維持TCA循環(huán)的正常運轉(zhuǎn)。

谷氨酸脫氫酶（6）還原氨基化反應:－酮戊二酸─────→谷氨酸葡萄糖中間產(chǎn)物a－酮戊二酸谷氨

酸谷氨酸脫氫酶NH4＋抑制谷氨酸的生物合成模式二、GA生物合成的內(nèi)在因素--產(chǎn)生菌的生化特點1、α—KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失2、GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH的在氧化能力欠缺或喪失3、產(chǎn)生菌體內(nèi)必須有乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶。4、菌體有強烈的L—谷氨酸脫氫酶活性

α-KGA+NH4++NADPH→GA+NADP反應機制如下：

異檸檬酸α—KGANADPHNADPα—KGAGA三、GA生物合成的最理想途徑與轉(zhuǎn)化率1、在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）體系不存在CO2固定反應，則有：則有：

3/2C6H12O6+NH4+→C5H9O4+4CO2

（來自何方？）產(chǎn)率：147/（180*3/2）=54.4%3/2Glucose丙酮酸丙酮酸丙酮酸++++乙酰輔酶A乙酰輔酶ACO2乙酰輔酶A檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）

谷氨酸

2、在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（封閉乙醛酸循環(huán)），存在CO2固定反應，則有：

C6H12O6+NH4+→C5H9O4+CO2

（來自何方？）產(chǎn)率：147/180=81.7%Glucose丙酮酸丙酮酸++C4二羧酸CO2乙酰輔酶A檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）

谷氨酸CO2在GA產(chǎn)生菌菌體內(nèi)CO2固定反應有以下兩條途徑：（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下

磷酸丙酮酸+CO2+GTP→草酰乙酸+GDP

(2)蘋果酸合成酶的作用下

丙酮酸+CO2+NADH→蘋果酸+NAD上述反應需要Mg2+、Mn+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充Mn+四、生物素在GA發(fā)酵中的作用1、生物素對發(fā)酵液pH值的影響

2、乙醛酸循環(huán)的封閉

DCA循環(huán)的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶，研究表明，該酶受以下幾個因素的影響：為醋酸誘導受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制當VH缺乏時：（1）丙酮酸的有氧氧化就會減弱(由于VH對TCA循環(huán)的促進作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導作用降低；（2）VH對TCA循環(huán)的促進作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強；兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。3、生物素對菌體生長的促進作用一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”——菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)另一方面，菌體的能和水平得到提高。——菌體增殖的能量的保證

以上分析說明，GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。五、菌體細胞膜滲透性的調(diào)節(jié)與控制意義：細胞膜滲透性的調(diào)節(jié)對于GA發(fā)酵時非常重要的，正如前述，當菌體進入產(chǎn)物合成期時，開始有GA的產(chǎn)生，這是如果能夠大量的把產(chǎn)物及時的排泄到細胞膜外，可以解除GA對L—谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用，從而實現(xiàn)由Glucose→GA的高效率轉(zhuǎn)化；反之，如果……

控制細胞膜的滲透性的途徑(1)通過生理學手段控制細胞膜滲透性(2)通過細胞膜缺損突變控制細胞膜滲透性生物素谷氨酸細胞膜滲透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸1、VH對菌體細胞膜滲透性的影響葡萄糖丙二酰輔酶A丙酮酸丙酮酸++CO2乙酰輔酶AC4CO2乙酰輔酶A乙酰輔酶A羧化酶CO2C6丙二酰輔酶A

脂肪酸＋甘油磷酸磷脂＋蛋白質(zhì)生物膜因此，脂肪酸是組成細胞膜類脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過細胞膜分泌至體外。

其中，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A的酶是乙酰輔酶A羧化酶，該酶的輔酶是VH，VH在此反應過程中起到傳遞CO2的作用。當培養(yǎng)基中VH的濃度較低時，細胞膜的合成就會受影響。

92%培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內(nèi)AA──→胞外

12%培養(yǎng)基中生物素豐富時，胞內(nèi)AA──→胞外2、使之合成不完整的細胞膜，造成膜的缺損，提高細胞膜的滲透性

甘油、油酸營養(yǎng)缺陷型的選育3、青霉素的使用

抑制肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽酶的活性，引起肽聚糖結(jié)構(gòu)中肽橋無法交聯(lián)，造成細胞壁缺損，在膨脹壓的作用下代謝物外滲，從而提高細胞膜的滲透性4、表面活性劑等六、GA發(fā)酵的外在因素1、培養(yǎng)基成分：主要是玉米漿

2、供氧濃度

過量：

NADPH的再氧化能力會加強，使α—KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA的生成。供氧不足：

積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。

3、NH4+濃度

（1）影響到發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：過低，不利于α—KGA的還原氨基化;過高，產(chǎn)生谷氨酰胺（在谷氨酰胺合成酶的作用下，谷氨酰胺的缺點？）

NH4+的供給方式：（1）液氨（2）流加尿素，條件和優(yōu)缺點？副反應：4、磷酸鹽不足：……過量：（1）促進EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等……

（2）產(chǎn)生并積累Val。帶來的問題是：（1）可以抑制葡萄糖→丙酮酸，進而使GA的生物合成受到阻止（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率（3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴重的影響GA的結(jié)晶、提出。焦磷酸硫胺素（TPP）葡萄糖活性乙醛丙酮酸丙酮酸+Valα—乙酰乳酸5、金屬離子（1）Mg2+

（2）Mn2+七、GA發(fā)酵生產(chǎn)中的異?，F(xiàn)象及其處理1、發(fā)酵前期pH值過高危害：影響因素：（1）耗糖速度過慢，就是糖的代謝速度過慢。（2）初脲量大、菌種脲酶活力高導致銨離子濃度高（3）前期感染phqge（4）培養(yǎng)基中缺乏磷酸鹽等。處理方法：（1）耗糖速度慢，通過測定糖的含量確定，可以強化通風、適當添加生物素等。（2）初脲量大，停止通風，或者小通風，以使尿素緩慢釋放銨離子。（3）感染phqge，（4）缺乏磷酸鹽……2、初期pH值偏低（1）初脲添加量不夠，提前酌情流加尿素。（2）跑尿：（3）培養(yǎng)基中的磷酸鹽過高，代謝平衡被打破，酸性產(chǎn)物的積累（4）供氧不足3、接種后菌體生長不良、OD值偏低、耗糖速度緩慢危害：發(fā)酵周期長、菌體活力低、糖酸轉(zhuǎn)化率偏低（1）可能感染phage（2）培養(yǎng)基存在問題：缺乏生物素缺乏磷酸鹽存在抑制性物質(zhì)：淀粉水解產(chǎn)生的抑制性物質(zhì)：培養(yǎng)基滅菌產(chǎn)生的（3）通風量過大，溶氧水平高。使得菌體耗糖速度降低。（能荷的問題）（4）種子不良，種子衰老；接種溫度過高，導致菌體被燙死。（5）前期通風較少，pH值偏低，代謝產(chǎn)物積累較多的酸性物質(zhì)，不利于菌體的生長。4、中后期，OD值繼續(xù)升高，好糖快，但是產(chǎn)酸很低危害：生生產(chǎn)上說的：只長菌、不產(chǎn)酸產(chǎn)生原因：（1）生物素濃度過高（2）可能是感染了雜菌鏡檢初步判斷是否感染了雜菌5、發(fā)酵中后期pH值低，耗糖快，但是產(chǎn)酸低或者不產(chǎn)酸（1）可能是感染了雜菌，上述情況。（2）供氧不足，導致酸性產(chǎn)物的積累（3）生物素濃度過高、磷酸鹽濃度過高，導致OD值增長太快，這些都是菌體大量增殖的有利條件。處理方法：大量的通風、提前流加尿素，迅速提升發(fā)酵液的pH值。6、發(fā)