第1章 組織培養(yǎng)技術(shù)的基本理論知識(新修)

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主講：周曉霞司徒鎮(zhèn)強(qiáng)

第一章

細(xì)胞培養(yǎng)的基本理論知識

組織培養(yǎng)工作開始于20世紀(jì)初，Harrison(1907)最早對兩棲類胚胎的神經(jīng)管組織進(jìn)行了懸滴培養(yǎng)-哈里森懸滴培養(yǎng)法

真正開創(chuàng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工作是在20世紀(jì)40年代，W.Earle和R.Dulbecco設(shè)計出了細(xì)胞培養(yǎng)液配方，并開始了單細(xì)胞的懸液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工作才得到廣泛發(fā)展。

細(xì)胞培養(yǎng)始傳我國是20世紀(jì)30年代。至50年代以后，組織培養(yǎng)已在我國逐步開展起來組織細(xì)胞培養(yǎng)的誕生和發(fā)展簡史

第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基本概念

一、細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)基本概念：

動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。

體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（InVitro）

組織培養(yǎng)

器官培養(yǎng)

一、什么是細(xì)胞培養(yǎng)？

(cellculture)

概念體外培養(yǎng)（Invitro）**

細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)：

是把取得之組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行培養(yǎng)生長。**

組織培養(yǎng)(Tissueculture)：

把活體的一小片組織置于底物上孵育，細(xì)胞自其周圍移出并生長。

**器官培養(yǎng)(Organculture)：系將活體中器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長并同時保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。多種學(xué)科均可利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行研究，如：細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、生化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等。可供實驗的組織來源眾多，包括各種動物的各類組織，可以是動物的胚胎或成體；可以是正常組織或腫瘤組織等?？寺⊙蚨嗬蚩寺『飭慰寺】贵w制備過程

優(yōu)點：

1.活細(xì)胞：

能長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等

二、細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點2.可控制：

選擇對象：均一性、重復(fù)性

哪一種：類型：上皮？間質(zhì)？

性質(zhì)：正常？腫瘤？

階段：

調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素可控

研究方法：可采用各種研究技術(shù)、記錄方法

3.應(yīng)用廣：學(xué)科多，對象廣。

4.較經(jīng)濟(jì)：

可提供大量、同時、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的主要優(yōu)點(小結(jié)）㈠研究的對象是活細(xì)胞。㈡研究的條件可以人為控制。㈢研究的樣本，可以達(dá)到比較均一性。㈣研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。㈤研究的范圍比較廣泛。㈥研究的費用相對較經(jīng)濟(jì)。缺點：雖然現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實際仍不完全相同。當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。１.與體內(nèi)主要不同相對孤立、相對單一，缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。2.主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細(xì)胞趨向單一化；3.提示

要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細(xì)胞：是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。

體內(nèi)、外細(xì)胞的差異:體內(nèi)細(xì)胞：

機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和其他類型細(xì)胞影響

基因表達(dá)受到外來信號調(diào)節(jié)

增殖過程中不斷發(fā)生著分化（由一般到特殊）

高度特化的結(jié)構(gòu)和功能體外細(xì)胞：失去機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和其他類型細(xì)胞影響細(xì)胞的許多外來信號被切斷特定分化基因表達(dá)減弱或停止而進(jìn)化中保守的增殖活動維持（由特殊到一般）與體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的差異特征：失去原有形態(tài)，分化特性減弱，形態(tài)和功能趨于單一，一定代數(shù)后衰老死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲不死性而成為能無限傳代

第二節(jié)組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)

一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型

按生長方式分為二型

粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。

懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。

絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞。

粘附型細(xì)胞：粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。

細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異：

體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為以下類型：

(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

(1)上皮型細(xì)胞(2)成纖維型細(xì)胞(3)游走型細(xì)胞(4)多形型細(xì)胞

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上皮樣細(xì)胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與上皮細(xì)胞類似的細(xì)胞來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞（個別例外）如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核

生長特點:易相連成片:相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀;生長時呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個活動

成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的細(xì)胞來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核

生長特點:

排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片;細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨行動游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起

體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞游走型細(xì)胞

具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。經(jīng)常處于較活躍的變形及游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。當(dāng)細(xì)胞密度增大相互連接成片時，游走受限，形狀上類似上皮型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞。表現(xiàn)這種形態(tài)的細(xì)胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝庫佛細(xì)胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。

多形型細(xì)胞

多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，但它不像成纖維細(xì)胞型的細(xì)胞那樣，不規(guī)則形態(tài)由寬扁的胞質(zhì)突起所致。其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒有成纖維細(xì)胞型那樣不規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。注意：細(xì)胞形態(tài)并非固定不變，可隨培養(yǎng)條件、生長時期、細(xì)胞數(shù)量等而變化細(xì)胞形態(tài)只是對培養(yǎng)物判斷或識別的參考指標(biāo)若要確定某一培養(yǎng)物的確切細(xì)胞類型，必須借助更為特異的鑒定方法，如進(jìn)行組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定:條件改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化

血清高血清低血清

Hela成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pH

太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

Hela成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度低密度高密度

3T3成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

3T3圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后3T3成纖維樣可成上皮樣懸浮生長型

概念培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源來自血，脾或骨髓，主要是血中白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞也可能特點在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點:

生存空間大，提供數(shù)量大傳代方便(不需消化)易于收獲缺點:

觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤其是正常細(xì)胞)

小結(jié)*：體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型粘附型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞：血細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞

上皮型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞

游走型細(xì)胞

多形型細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化分化特征逐漸減弱，原本各種各樣的分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個性”，表現(xiàn)出某種趨同性，這種現(xiàn)象被稱為去分化或脫分化培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力

分裂增殖和生長發(fā)育是體外培養(yǎng)細(xì)胞的兩大生命特征;增殖能力一般與該種細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力相仿。

根據(jù)增殖狀況，體內(nèi)細(xì)胞分三類：·連續(xù)分裂細(xì)胞(cyclingcell):這類細(xì)胞始終保持著活躍的分裂能力。如造血組織，胃腸粘膜上皮，體表皮細(xì)胞等。特點：細(xì)胞代謝旺盛，壽命較短，更替快。

·休眠細(xì)胞(Go細(xì)胞):在平常情況下它們不進(jìn)行分裂，如肝、腎、甲狀腺等細(xì)胞，但在一定條件下，可以重新進(jìn)入細(xì)胞周期，出現(xiàn)活躍的細(xì)胞分裂。·終末分化細(xì)胞:終生不再分裂。二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程１）單個細(xì)胞的生長過程：ＤＮＡ合成細(xì)胞分裂

復(fù)習(xí)：細(xì)胞周期＝Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ細(xì)胞通過什么方式增殖？細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖細(xì)胞增殖一個細(xì)胞周期分四個時期：G1、S、G2、M期。G1SG2MG0

概念：連續(xù)分裂的細(xì)胞，從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，為一個細(xì)胞周期。細(xì)胞周期

階段分裂間期：G1、S、G2分裂期：

M期前期中期后期末期

細(xì)胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉(zhuǎn)，在間期細(xì)胞體積增大(生長)，在M期細(xì)胞先是核分裂，接著胞質(zhì)分裂，完成一個細(xì)胞周期。一次分裂結(jié)束下次分裂開始下次分裂結(jié)束分裂間期分裂期細(xì)胞周期①細(xì)胞的種類不同，一個細(xì)胞周期的時間也不相同。②分裂間期的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分裂期的時間。（90%--95%）

（5%--10%）規(guī)律:細(xì)胞周期中各期的生化特點:G1期：從有絲分裂完成到DNA復(fù)制之前這一階段，又稱為復(fù)制前期。該期細(xì)胞內(nèi)各種RNA、蛋白質(zhì)、糖、脂等合成增多。同時該期是各種細(xì)胞群體之間細(xì)胞周期的差異取決于此期。S期：又稱為DNA合成期或復(fù)制期。該期細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)從二倍體到四倍體。同時組蛋白的合成也同時進(jìn)行。G2期：指DNA合成完成到有絲分裂開始這段時間，又稱復(fù)制后期。該期DNA合成已終止，但仍然進(jìn)行著RNA和一定蛋白合成。同時線粒體DNA在此期復(fù)制。M期：又稱為有絲分裂期。此期細(xì)胞呈球形，染色體在此期凝聚后分開，移向細(xì)胞兩端，解聚并再形成兩個完整的核，最后