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生化制藥工藝AcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplanAcompletebusinessplan項目五基因工程制藥1基因工程的概念2基因工程操作工具3基因工程操作流程目錄CONTENTS基因工程常用工具02Part2基因工程操作工具一、基因工程操作工具1、基因工程操作要求基因的大小以納米計算,要對它進行剪切、拼接等操作,沒有非常精細的工具是無法進行的。2、基因工程操作工具“分子手術(shù)刀”----限制性核酸內(nèi)切酶
“分子縫合針”----DNA連接酶“分子運輸車”----載體Part2基因工程操作工具二、限制性內(nèi)切酶1、工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列,切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵,使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的5
3
聚合、35
外切活性,而無53
外切活性。常用于cDNA第二鏈合成,雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補,標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化,或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基Part2基因工程操作工具二、限制性內(nèi)切酶2、限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型作用與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng),限制外源DNA,保護自身DNA命名命名Hin
dⅢ
屬
種
株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名,用大寫第二、第三個字母是該細菌的種名,用小寫第四個字母代表株羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序Part2基因工程操作工具二、限制性內(nèi)切酶2、限制性內(nèi)切酶識別位點----回文結(jié)構(gòu)(palindrome)雙鏈DNA中含有的二個結(jié)構(gòu)相同、方向相反的序列切口平端切口粘端切口GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性內(nèi)切酶2、限制性內(nèi)切酶同功異源酶來源不同的限制酶,但能識別和切割同一位點GGATCCCCTAGG+BamHⅠGCCTAGGATCCGBstⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+Part2基因工程操作工具二、限制性內(nèi)切酶2、限制性內(nèi)切酶同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同,但切割DNA后,產(chǎn)生相同的粘性末端,稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)BglⅡ+BamHⅠ+GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCGAGATCTTCTAGAATCTAGGATCTAPart2基因工程操作工具二、DNA連接酶1、DNA連接酶作用和分類作用催化形成3,5-磷酸二酯鍵分類E·coliDNA連接酶來源于大腸桿菌,可用于連接粘性末端T4DNA連接酶來源于T4噬菌體,可用于連接粘性末端和平末端,但連接效率低熱穩(wěn)定的DNA連接酶從嗜熱高溫放線菌(Thermoactinomycesthermophilus)菌株中分離純化的,一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的一種核酸酶Part2基因工程操作工具二、DNA連接酶2、不同的DNA連接酶對比連接酶底物輔助因子和激活因子溫度巰基試劑黏性末端平末端DNA-RNA雜合體RNA-RNA雜合體大腸桿菌DNA連接酶可行可行不行不行NAD+,Mg2+(1~3mmol/L)黏性末端:10~15℃補平缺口:37℃無T4DNA連接酶可行可行可行可行ATP,Mg2+(10mmol/L)黏性末端:4℃平末端:10~25℃補平缺口:37℃DTT嗜熱菌連接酶可行不行不行不行NAD+,Mg2+(10mmol/L)黏性末端:24~37℃補平缺口:65~72℃無Part2基因工程操作工具三、基因載體1、載體定義和分類定義能攜帶目的基因,實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子為什么要利用載體游離的DNA進入細胞體,一般會直接被分解,就算可以進行轉(zhuǎn)錄----翻譯成蛋白,游離DNA也無法跟著細胞分裂進行復(fù)制,導(dǎo)致子代細胞中不再含有目的基因分類克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體穿梭載體用于真核生物DNA片段在原核生物中克隆和鑒定(容易),然后在真核細胞宿主表達Part2基因工程操作工具三、基因載體2、載體選擇標準能自主復(fù)制具有兩個以上的遺傳標記物,便于重組體的篩選和鑒定有克隆位點(外源DNA插入點)即多個單一酶切位點分子量小,以容納較大的外源DNA3、常用載體
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