擬南芥根皮層細胞膜片鉗定向鉀電流全細胞研究

擬南芥根皮層細胞膜片鉗定向鉀電流全細胞研究

鉀是高等植物生長發(fā)育所必需的唯一一價陽離子。植物吸收k+的主要機制之一是根生質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)k-m通道。在80年代中期之前，人們對植物k-k的表面特征進行了研究。后來，用膜片唑酮技術(shù)對一些植物的根系之間的k-s-u型遺傳因素進行了一些研究，但由于許多植物的遺傳背景復(fù)雜，這些研究的深入難度較大。因此，利用簡單的遺傳背景（例如擬南角）進行相關(guān)研究對于提高研究活動非常重要。1992年，anderson等人和sentan等人成功地將k-k通道基因（kat1和kat1）轉(zhuǎn)移到了準(zhǔn)南角。kat1和act1是k-i；研究發(fā)現(xiàn)，由于缺乏突變植物，祖母突變植物恢復(fù)了對k的吸收。通過這種方式，ichida等人成功地將k-c1m遺傳因素轉(zhuǎn)嫁給了準(zhǔn)南角，并從母細胞貧血和后代昆蟲保護細胞中獲得了k-c1m。為了提高植物k-c的營養(yǎng)性，提高了它們的抗腫脹性。然而，這些研究工作的發(fā)展有賴于根中細胞膜上k-l的電生理特性以及k-l通道k的自我適應(yīng)機制。雖然有報道稱，在整個根細胞中，我們必須系統(tǒng)地研究k-l細胞的內(nèi)部k-s-c通道的特性以及k-l通道誘導(dǎo)機制。本工作利用膜片鉗技術(shù)對擬南芥根皮層細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向+通道進行了全細胞記錄對通道的K+吸收特性、K+/Na+選擇性、胞質(zhì)Ca2+等因子對通道的調(diào)控作用等進行了研究,旨在為利用模式植物深入開展植物K+吸收分子機理以及作物K+營養(yǎng)性狀改良的研究工作奠定基礎(chǔ).此外,對根細胞K+通道的K+/Na+選擇性與植物抗鹽性間的關(guān)系也進行了討論.1材料和方法1.1幼根的生長分離擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.cv.Landsberg)種子經(jīng)0.5%(體積比,有效氯含量)次氯酸鈉加0.01%(體積比),TritonX-100表面消毒5min,用無菌水沖洗后,播種于MS固體培養(yǎng)基上,在4℃下春化3d,在22℃連續(xù)光照(光強30μmol·m-2·s-1)條件下培養(yǎng)3周.取擬南芥幼根,切成2mm左右根段,置于100μm孔徑的尼龍網(wǎng)袋內(nèi),將網(wǎng)袋放入離心管內(nèi),加入1mL含1.5%纖維素酶(CEL,WorthingtonBiochemicalCorporation,USA)、0.1%果膠酶(Y-23,KikkomanCorporation,Japan)、0.1%BSA(BoehringerMannheim,Germany)的原生質(zhì)體分離酶液(溶于基本溶液內(nèi),見表1),在(25±2)℃條件下靜置20min后,在300×g條件下離心5min,去掉尼龍網(wǎng)和酶液,用基本溶液懸浮管內(nèi)沉淀物,再將沉淀物在250×g條件下離心5min,去掉上清液,用基本溶液再次將沉淀物懸浮,最后在250×g條件下離心5min,去掉上清液,用200μL基本溶液將沉淀的根細胞原生質(zhì)體懸浮,4℃下保存?zhèn)溆?1.2電流、電極和電極的選擇樣品池內(nèi)加入1mL胞外溶液(見表1),吸取10μL擬南芥根細胞原生質(zhì)體懸浮液加入樣品池后靜置10min,使原生質(zhì)體穩(wěn)固地沉于樣品池底部.選擇直徑大于15μm、細胞質(zhì)清晰的原生質(zhì)體(根皮層細胞)用于記錄.本實驗使用的電流放大器為Axopatch200B,前置放大器為CV203BU,信號接口為Digidata1200Series,軟件為pCLAMP6.0.3(均為美國AxonInstrument產(chǎn)品).電極使用有芯毛細管,采用兩步法拉制,熱拋光后灌注電極溶液(胞內(nèi)溶液,見表1).選擇電阻為20MΨ的電極用于全細胞記錄.全細胞的高阻封接(約為1～3GΨ)一般在1min內(nèi)形成,利用電流放大器的電阻和電容補償系統(tǒng)進行串聯(lián)電阻補償和電極與細胞的電容補償.階躍指令電位從-180mV開始,以每階20mV遞升,記錄時間為4s,間隔為12s.1.3ca2+濃度本實驗對照處理的各種溶液成分見表1.含不同濃度K+的胞外溶液是通過改變對照胞外溶液的Glu-K濃度而配制;含TEA+或Ba2+的胞外溶液是分別在對照的胞外溶液中加入10mmol/LTEA-Cl或1mmol/LBaCl2.含不同濃度自由Ca2+的溶液是在胞內(nèi)溶液中分別加入不同濃度的CaCl2,加入量用Ca2+濃度計算軟件(MAXChelatorV5.60)計算,使自由Ca2+的濃度分別為1.5,10和500μmol/L.以上各種溶液的滲透濃度用山梨糖醇調(diào)節(jié),pH用KOH調(diào)節(jié).各種溶液使用前經(jīng)微孔直徑為0.2μm的濾膜過濾.2結(jié)果2.1內(nèi)外主要離子平衡電位擬南芥根細胞原生質(zhì)體在胞外溶液含10mmol/LK+、電極溶液含100mmol/LK+時,保持電位設(shè)在-58mV,當(dāng)膜電位超過-100mV時,可記錄到明顯的內(nèi)向電流;膜電位越負則內(nèi)向電流越大(圖1(a)、(b)).其電流密度/電壓關(guān)系如圖1(b).通過尾電流記錄分析跨膜電流變化(圖1(c)),內(nèi)向電流的逆轉(zhuǎn)電位(Erev)為-37mV,據(jù)能斯特方程對細胞內(nèi)外主要離子平衡電位的計算(表2)表明,擬南芥根細胞質(zhì)膜的逆轉(zhuǎn)電位接近K+的平衡電位(-58mV),證明擬南芥根細胞原生質(zhì)體的全細胞內(nèi)向電流主要是K+電流.在胞外溶液中加入10mmol/LTEA+,當(dāng)膜電位為-180mV時,內(nèi)向電流被抑制72.2%(圖2(a)、(b)、(d)),而在胞外溶液中加入1mmol/LBa2+則完全抑制內(nèi)向K+電流(圖2(c)、(d)).由于TEA+和Ba2+均是K+離子通道的抑制劑,所以實驗結(jié)果進一步證明了所記錄的擬南芥根皮層細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向離子通道主要是內(nèi)向K+通道.在相同的膜電位條件下,全細胞內(nèi)向電流密度隨胞外K+濃度的降低而逐漸減小(圖3),而其逆轉(zhuǎn)電位隨胞外溶液K+濃度的降低向負值更大的方向移動(圖3(g)),說明擬南芥根皮層細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道活性具有依賴于胞外K+濃度的特性,其電流密度/電壓關(guān)系如圖3(g)所示.根據(jù)Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖法,以電流密度值為縱坐標(biāo)、以電流密度與相應(yīng)的K+濃度的比值為橫坐標(biāo)作圖(圖3(g)),胞外K+濃度在1～10mmol/L范圍內(nèi),擬南芥根細胞內(nèi)向K+通道的K+吸收的平衡解離常數(shù)(Km)為12.6mmol/L,表明擬南芥根皮層細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道主要是介導(dǎo)植物低親和性K+吸收.2.2glu-na的選擇性在對照的胞外溶液內(nèi)加入10mmol/L的谷氨酸鈉(Glu-Na)時,其內(nèi)向跨膜電流密度與對照的跨膜電流密度(圖4(a)、(e))相比約減少62.0%(圖4(b)、(e)).以Glu-Na替換對照胞外溶液中的Glu-K時(同時含0.1mmol/LGlu-K),由于胞外Na+的濃度遠高于胞內(nèi)Na+濃度,根據(jù)能斯特方程推算,Na+的平衡電位遠大于零.在膜電位小于零時,Na+的電化學(xué)勢是質(zhì)膜外側(cè)高于質(zhì)膜內(nèi)側(cè),但在全細胞電流記錄中,當(dāng)膜電位達到-180mV時也未記錄到明顯的內(nèi)向電流圖內(nèi)向電流密度只有這與胞外溶液只含有K+的全細胞記錄結(jié)果相似((0.06±0.02)pA/pF)(圖4(c)、(e)).實驗結(jié)果說明擬南芥根細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向離子通道具有極強的K+/Na+選擇性.2.3內(nèi)向電流密度t當(dāng)胞內(nèi)自由Ca2+濃度約為0.1μmol/L(對照)時,在膜電位為-180mV條件下細胞的內(nèi)向跨膜K+電流密度為(71.1±8.9)pA/pF(圖5(a)、(e)).在保持胞外Ca2+濃度(1mmol/L)不變的條件下,當(dāng)胞內(nèi)自由Ca2+濃度分別為1.5和10μmol/L時,在膜電位為-180mV的條件下,擬南芥根細胞質(zhì)膜上內(nèi)向K+電流密度分別為(68.0±6.8)pA/pF和(65.6±8.9)pA/pF(圖5(b)、(c)、(e)).經(jīng)t測驗,2種較高濃度Ca2+處理的內(nèi)向電流密度與對照的內(nèi)向電流密度差異均不顯著.在電極溶液加入2.5mmol/LCaCl2和2mmol/LEGTA,使胞內(nèi)自由Ca2+濃度約為500μmol/L時,內(nèi)向電流密度仍有(57.5±5.8)pA/pF(圖5(d)、(e)),與對照的內(nèi)向跨膜電流密度相比差異也不顯著測驗3討論3.1種植物的k+/na+選擇性能不同種類植物其細胞膜上的K+通道的K+/Na+選擇性之間存在差別.如小麥根毛細胞原生質(zhì)體質(zhì)膜上K+通道對Na+和K+的電導(dǎo)比為0.013;但玉米根皮層細胞膜上的一種K+通道對Na+和K+的電導(dǎo)比卻為0.023.同種植物的不同生態(tài)型間也存在著離子通道的K+/Na+選擇性差別,如擬南芥Columbia生態(tài)型的根細胞質(zhì)膜上存在的內(nèi)向K+通道,其K+/Na+選擇性不高,在單通道記錄方式下Na+透過率相對于K+透過率的比值為0.17,而本工作以擬南芥Landsberg生態(tài)型為試材,其根細胞質(zhì)膜上K+通道具有極高的K+/Na+選擇性,在-120～-180mV的范圍內(nèi),其Na+和K+的電導(dǎo)比約為0.0009.較高的K+/Na+選擇性可能有利于植物在同時含有K+和Na+的環(huán)境中有效地吸收K+.3.2根細胞的保鹽功能抗鹽植物適應(yīng)高鹽環(huán)境的機理有多種,如通過根對離子的選擇性吸收、在地上部排出鹽分、在植物特定的組織中隔離鹽分等.在細胞水平,離子跨質(zhì)膜和/或液泡膜運輸?shù)臋C制及其調(diào)控與植物的抗鹽性狀密切相關(guān).植物細胞在高鹽環(huán)境中保持其胞內(nèi)Na+濃度較低的機制可能有二,一是在確保其他離子吸收的條件下,選擇性地排斥Na+,不讓其透過質(zhì)膜;另一是從細胞內(nèi)向胞外或液泡內(nèi)耗能性的轉(zhuǎn)運Na+.由于植株在Na+吸收、運轉(zhuǎn)和最終的毒害過程中,最初開始于根細胞的質(zhì)膜而且在液泡中隔離鹽分只能短時間解決鹽分過高的問題因此對于單個細胞來說,拒Na+于質(zhì)膜之外無疑是植物抗鹽的最重要的機制之一.由于在鹽脅迫環(huán)境下,胞外Na+濃度一般遠高于胞內(nèi)的Na+濃度,Na+可以沿其電化學(xué)勢梯度被動進入胞內(nèi).應(yīng)用膜片鉗技術(shù)以全細胞或單通道方式研究植物細胞離子通道的特性發(fā)現(xiàn),至少在小麥、黑麥、大麥、玉米和豌豆等植物的不同類型根細胞上的確存在可以部分透過Na+的內(nèi)向K+通道,所以在鹽脅迫條件下,Na+可能是通過內(nèi)向K+通道進入植物體內(nèi),而使植株遭受鹽害.雖然現(xiàn)在還不能明確是否不同抗鹽性植物在高鹽環(huán)境下其根細胞質(zhì)膜上內(nèi)向K+通道的K+/Na+選擇性與其抗鹽性間存在必然聯(lián)系(即根細胞質(zhì)膜內(nèi)向離子通道K+/Na+選擇性高的植株是否也表現(xiàn)出較高的抗鹽性,反之亦然),但有研究表明可能在植物的K+/Na+選擇性與抗鹽性間存在一定的關(guān)系.如具有較高K+/Na+選擇性的普通小麥(Triticumaestivum)的抗鹽性強于K+/Na+選擇性較低的硬粒小麥(Triticumturgidum).而我們實驗室最近的研究表明,擬南芥至少可以在含150mmol/LNaCl的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(尚未發(fā)表),同時本實驗結(jié)果證明了擬南芥根細胞質(zhì)膜上存在++選擇性極高的內(nèi)向+通道但擬南芥的高抗鹽性與其高的K+/Na+選擇性間的這種聯(lián)系是否具有普遍性還有待于進一步證實.3.3植物根細胞中內(nèi)k+通道對胞內(nèi)自由ca2+濃度變化的不敏感性Ca2+對一些植物細胞離子通道的調(diào)控是Ca2+調(diào)節(jié)植物生理生化活動的重要機制之一.如植物葉片氣孔保衛(wèi)細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道的活性受Ca2+的顯著抑制,而保衛(wèi)細胞質(zhì)膜上的氯通道則被Ca2+所激活.但有些植物細胞的離子通道卻對胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的變化并不敏感.本工作的實驗結(jié)果表明,擬南芥根細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道對胞內(nèi)自由Ca2+濃度變化不敏感,即使是在胞內(nèi)Ca2+濃度為500μmol/L時,其內(nèi)向K+電流仍未受到明顯影響.對黑麥、大麥等植物根皮層細胞膜上K+通道的研究表明,不同植物根皮層細胞膜上的K+通道對胞質(zhì)Ca2+的變化均不敏感.植物根細胞質(zhì)膜上的內(nèi)向K+通道對胞內(nèi)自由Ca2+濃度變化的不敏感性有可能是此類K+通道的一種共同特性.許多研究業(yè)已