食品中肉毒梭菌的PCR檢測方法樣本

食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ檢測方法科標檢測1、范圍本標準適用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的檢測。

青島科標檢測研究院經過了山東省質量技術監(jiān)督局(CMA)和中國合格評定國家認可委員會(CNAS)認證認可,是權威的第三方檢測機構。旗下科標生物實驗室在微生物檢測領域擁有豐富的經驗,能夠針對食品、醫(yī)藥、化妝品、農產品、一次性產品以及工業(yè)產品等進行微生物檢測以及產品微生物污染分析,為客戶提供快速、高效、權威的第三方微生物檢測服務,保證產品質量安全,專業(yè)得到了國內、國際知名企業(yè)的廣泛認可。能夠按照各種標準提供微生物檢測服務。規(guī)范性引用文件ＧＢ／Ｔ４７８９．１２食品衛(wèi)生微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗ＧＢ／Ｔ６６８２分析試驗室用水規(guī)格和實驗方法ＧＢ１９４８９實驗室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測ＳＮ／Ｔ１１９３基因檢驗實驗室技術要求3、術語、定義和略縮語3.1肉毒梭菌肉毒梭菌為梭菌科梭菌屬革蘭氏陽性芽孢桿菌,厭氧,在適宜的培養(yǎng)基及特定的環(huán)境條件下產生一類具有很強毒性的神經麻痹毒素,即肉毒毒素。3.2聚合酶鏈式反應模板ＤＮＡ先經高溫變性成為單鏈,在ＤＮＡ聚合酶作用和適宜的反應條件下,根據模板序列設計的兩條引物分別與模板ＤＮＡ兩條鏈上相應的一段互補序列發(fā)生退火而相互結合,接著在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四種脫氧核糖核酸(ｄＮＴＰ)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的ＤＮＡ片段呈幾何倍數(shù)擴增。3.3縮略語Bp堿基對DNA脫氧核糖核酸dNTP脫氧核苷三磷酸dATP脫氧腺苷三磷酸dCTP脫氧胞苷三磷酸dGTP脫氧鳥苷三磷酸dTTP脫氧胸苷三磷酸Taq水生棲熱菌Tris三(羥甲基)氨基甲烷EDTA乙二胺四乙酸4、生物安全措施為了保護實驗室人員的安全,應由具備資格的工作人員檢測肉毒梭菌,所有培養(yǎng)物和廢棄物應小心處理,并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有關規(guī)定執(zhí)行。5、防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的規(guī)定執(zhí)行。6、方法提要樣品經增菌后劃平板分離單菌落,挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培養(yǎng),對培養(yǎng)物采用熱裂解抽提ＤＮＡ法,或商品化細菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒抽提ＤＮＡ法制備ＰＣＲ模板,進行ＰＣＲ擴增,瓊脂糖凝膠電泳檢驗ＰＣＲ產物是否有特征條帶,從而對食品中是否污染肉毒梭菌進行快速檢驗。7、設備和材料7.1天平:感量０．００１ｇ。7.2生物安全柜。7.3厭氧培養(yǎng)裝置。7.4恒溫培養(yǎng)箱:３５℃±１℃和２８℃±１℃。7.5高壓滅菌鍋。7.6恒溫水浴:３７℃±１℃和６０℃±１℃。7.7速臺式冷凍離心機:１４０００ｇ。7.8冰箱:－２０℃和－７０℃。7.9ＰＣＲ儀。7.10電泳儀。7.11凝膠成像分析系統(tǒng)。7.12紫外分光光度計。7.13微量可調移液器:０．２μＬ～２μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。7.14離心管:１．５ｍＬ。7.15ＰＣＲ反應管:２００μＬ～５００μＬ。8、培養(yǎng)基和試劑除另有規(guī)定外,試劑為分析純或生化試劑,水應符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一級水的規(guī)格。8.1庖肉培養(yǎng)基8.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(ＴＰＧＹ)8.3厭氧卵黃瓊脂8.4無水乙醇和９５％乙醇8.5ＰＢＳ緩沖液:氯化鈉７．６５０ｇ／Ｌ、磷酸氫二鈉０．７２４ｇ／Ｌ、磷酸二氫鉀０．２１０ｇ／Ｌ(ｐＨ７．４)8.6ＴＥ緩沖液:１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)8.7蛋白酶Ｋ溶液:用ＴＥ配制,使用濃度為１０ｍｇ／ｍＬ8.8溶菌酶溶液:用ＴＥ配制,使用濃度為１０ｍｇ／ｍＬ8.9３ｍｏｌ／Ｌ乙酸鈉溶液(ｐＨ５．２)8.10２０％ＳＤＳ溶液8.11引物:根據附錄Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物,加超純水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ儲液,用于ＰＣＲ測試的引物濃度為１０μｍｏｌ／Ｌ。8.12TaqＤＮＡ聚合酶8.13ｄＮＴＰ:ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。8.14瓊脂糖:電泳級8.15溴化乙錠8.16ＤＮＡ分子量標準8.17陽性對照:含有擴增片段的質?；颍痢ⅲ?、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因組ＤＮＡ8.18商品化細菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒8.19１０×ＰＣＲ緩沖液:２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ(ｐＨ８．４)、２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鉀、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂。8.20５×ＴＢＥ電泳緩沖液:Ｔｒｉｓ５４ｇ、硼酸２７．５ｇ、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)２０ｍＬ,加蒸餾水至１０００ｍＬ,使用時稀釋為０．５×ＴＢＥ電泳緩沖液8.21６×加樣緩沖液:３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ,３６％(體積分數(shù))甘油,０．０５％(質量濃度)二甲苯腈藍ＦＦ,０．０５％(質量濃度)溴酚藍9、檢驗程序檢驗程序見圖１10、檢驗步驟10.1樣品制備和增菌培養(yǎng)接種前,先將增菌培養(yǎng)基煮沸１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ,以排除溶解于培養(yǎng)基中的氧,并迅速冷卻,切勿搖動。每１５ｍＬ增菌肉湯中接種１ｇ～２ｇ固體食品或１ｍＬ～２ｍＬ液體食品,接種時將接種物慢慢接入肉湯液面以下。每份樣品接種兩管庖肉培養(yǎng)基,置３５℃±１℃,同時接種兩管ＴＰＧＹ培養(yǎng)基,置２８℃±１℃,厭氧培養(yǎng)５ｄ。檢查培養(yǎng)物的濁度、產氣、肉粒的消化和產生的氣味。若有生長,按１０．２分離純培養(yǎng)物。若未見生長,則繼續(xù)培養(yǎng)１０ｄ。10.2分離純培養(yǎng)物?。保恚獭玻恚膛囵B(yǎng)液置于螺旋帽試管中,加入等量過濾除菌的無水乙醇?；靹?在室溫下放置１ｈ?；颍福啊婕訜幔保埃恚椋睢保担恚椋钜云茐钠浞敝丑w。用接種環(huán)?。杯h(huán)～２環(huán)經乙醇或加熱處理的培養(yǎng)物在厭氧卵黃瓊脂上劃線接種,置厭氧條件下３５℃±１℃培養(yǎng)４８ｈ。挑取約１０個單個的典型菌落。肉毒梭菌的菌落為隆起或扁平,光滑或粗糙,容易蔓延生長并有不規(guī)則邊緣。在卵黃培養(yǎng)基上用斜射光檢查時,菌落表面一般呈虹彩樣,亦稱為珠色層。彩帶一般向外延伸,繼而菌落產生不規(guī)則外形。接種可疑菌落到ＴＰＧＹ培養(yǎng)基中,置３５℃±１℃厭氧培養(yǎng)２４ｈ。10.3模板ＤＮＡ的制備以下兩種方法任選一種進行。剩余培養(yǎng)液置４℃保存,以備確證試驗使用。10.3.1熱裂解抽提ＤＮＡ法取１．４ｍＬＴＰＧＹ培養(yǎng)物轉移至１．５ｍＬ離心管中,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,棄去上清液。加入１．０ｍＬＰＢＳ懸浮菌體沉淀,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,去上清。用４００μＬＰＢＳ重懸沉淀,加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１００μＬ,３７℃±１℃水?。保担恚椋?期間每５ｍｉｎ～７ｍｉｎ顛倒混勻離心管。加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液１０μＬ,６０℃±１℃水?。保?期間每１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ顛倒混勻離心管。沸水?。保埃恚椋?１４０００g離心２ｍｉｎ,上清液轉移至新的滅菌小離心管中。加入３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液５０μＬ和９５％乙醇１．０ｍＬ,顛倒混勻,－７０℃或－２０℃放置３０ｍｉｎ,１４０００ｇ１０ｍｉｎ,棄去上清,沉淀干燥后溶于２００μＬＴＥ溶液。按１０．４進行純度和濃度測定后置于－２０℃保存。10.3.2試劑盒抽提ＤＮＡ法?。保矗恚蹋裕校牵倥囵B(yǎng)物轉移至１．５ｍＬ離心管中,１４０００ｇ離心２ｍｉｎ,棄去上清液。菌體沉淀用１．０ｍＬＴＥ緩沖液洗兩次后重懸于１２０μＬ的２５％蔗糖溶液中。加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１２０μＬ,混勻,３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ;然后加入２０％ＳＤＳ溶液３０μＬ,輕輕混勻,室溫放置５ｍｉｎ;再加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液９．０μＬ,混勻后３７℃±１℃水?。常埃恚椋睢腋∫翰捎蒙唐坊毦蚪MＤＮＡ提取試劑盒提?。模危?使用時按照試劑盒說明書進行操作。提取的ＤＮＡ按１０．４進行純度和濃度測定后置于－２０℃保存。10.4核酸純度和濃度的測定取適量ＤＮＡ溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測２６０ｎｍ和２８０ｎｍ處的吸收值。ＤＮＡ的濃度按照式(１)計算。C＝Ａ260×Ｎ×５０……(１)式中:C——ＤＮＡ濃度,單位為微克每毫升(μｇ／ｍＬ);Ａ260——２６０ｎｍ處的吸光值;Ｎ——核酸稀釋倍數(shù)。當濃度為０．３４μｇ／ｍＬ～３４０μｇ／ｍＬ,Ａ260／Ａ280比值在１．７～１．９之間時,適宜于ＰＣＲ擴增。10.5ＰＣＲ擴增10.5.1采用分別針對Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌肉毒毒素基因設計的型特異性引物,進行多個ＰＣＲ擴增,每個ＰＣＲ反應管檢測一種類型的肉毒梭菌。10.5.2ＰＣＲ反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當?shù)恼{整。10.5.3ＰＣＲ檢測時反應體系應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。用含有擴增片段的質?；颍痢ⅲ?、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因組ＤＮＡ作陽性對照,用非肉毒梭菌基因組ＤＮＡ作陰性對照,用無菌水作空白對照。10.6凝膠電泳檢測ＰＣＲ產物用０．５×ＴＢＥ緩沖液制備１．２％～１．５％(質量濃度)的瓊脂糖凝膠(凝膠加熱融化后冷卻至６０℃左右加入溴化乙錠至０．５μｇ／ｍＬ,或者在電泳后用０．５μｇ／ｍＬ溴化乙錠溶液進行染色),將１０μＬ的ＰＣＲ產物與２．０μＬ６×加樣緩沖液混合,點樣,其中一孔加入ＤＮＡ分子量標準,以判斷ＰＣＲ產物的片段大小。０．５×ＴＢＥ電泳緩沖液,１０Ｖ／ｃｍ恒壓電泳,電泳時間根據溴酚藍的移動位置來確定,電泳檢測結果用凝膠成像系統(tǒng)記錄。11、ＰＣＲ結果判定陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)條帶,陽性對照出現(xiàn)預期大小的擴增條帶,待測樣品出現(xiàn)預期大小的擴增條帶,判定為ＰＣＲ結果陽性,按第１２章進行確證試驗;待測樣品未出現(xiàn)預期大小的擴增條帶,判定ＰＣＲ結果為陰性,按第１３章直接報告結果。實驗中設置的陰性對照、空白對照和陽性對照ＰＣＲ檢測結果應符合上述情況。否則,任一種對照如果出現(xiàn)非上述正常結果,應重做實驗。12、確證試驗取１０．３剩余培養(yǎng)液,按ＧＢ／Ｔ４７８９．１２規(guī)定的方法進行確證試驗。13、結果報告ＰＣＲ結果陰性,直接報告”未檢出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。確證試驗結果為檢出肉毒梭菌,則報告”檢出某型(Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型)肉毒梭菌”。確證試驗結果為未檢出肉毒梭菌,則報告”未檢出Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌”。附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑的配制A.1庖肉培養(yǎng)基A.1.1成分新鮮牛肉５００．０ｇ蛋白胨３０．０ｇ酵母浸膏５．０ｇ磷酸二氫鈉５．０ｇ葡萄糖３．０ｇ可溶性淀粉２．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬA.1.2制法將新鮮除脂肪和筋膜的牛肉５００ｇ切碎,加入蒸餾水。加熱至沸點,再以文火煮１ｈ。充分冷卻,經紗布過濾,擠出余液。加入其它成分,用蒸餾水將液體體積補足至１０００ｍＬ。調節(jié)ｐＨ至７．４±０．１,經粗濾紙過濾。在１５ｍｍ×１５０ｍｍ試管中先加入碎肉渣至３ｃｍ高,然后加入肉湯,超過肉渣表面約４ｃｍ,上面覆蓋一層液體石蠟,厚度為０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃高壓滅菌２０ｍｉｎ。A.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉湯(TPGY)A.2.1成分胰酪胨５０．０ｇ蛋白胨５．０ｇ酵母浸膏２０．０ｇ葡萄糖４．０ｇ硫乙醇酸鈉１．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬA.2.2制法將固體成分溶于１０００ｍＬ蒸餾水中,再分裝１５ｍｍ×１５０ｍｍ試管,每管１５ｍＬ。上面覆蓋一層液體石蠟,厚度為０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃下高壓滅菌１０ｍｉｎ。最終ｐＨ為７．０±０．１。放冰箱內保存,若２周內不用則棄掉。臨用前,將基礎液用蒸汽或煮沸加熱１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ,以排除游離氧,迅速冷卻。A.3厭氧卵黃瓊脂A.3.1瓊脂基礎酵母浸膏５０．０ｇ胰胨５．０ｇ蛋白胨２０．０ｇ氯化鈉５．０ｇ瓊脂２０．０ｇ蒸餾水１０００ｍＬ在１２１℃下高壓滅菌１５ｍｉｎ。最終ｐＨ為７．０±０．２。A.3.2卵黃乳狀液用硬刷洗刷２個～３個雞蛋,瀝干。將雞蛋放在０．１％氯化汞溶液中浸泡１ｈ,再用７０％乙醇浸泡３０ｍｉｎ。取出雞蛋,以無菌操作打開,棄去蛋白。用注射器取出蛋黃,放入滅菌容器,加等量滅菌生理鹽水,充分混合,存于４℃?zhèn)溆?。A.3.3制法每５００ｍＬ瓊脂基礎液(４８℃～５０℃)加８０ｍＬ卵黃乳狀液,充分混合,制成平板。室溫放置２ｄ,或３５℃放置２４ｈ。剔除污染的平板,將無菌平板存于冰箱。

附錄B(規(guī)范性附錄)肉毒梭菌ＰＣＲ檢測方法參照表表B.1肉毒梭菌肉毒毒素基因ＰＣＲ檢測的引物序列檢測肉毒梭菌類型引物序列擴增長度／ｂｐＡ型正:５’-ＧＴＧＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴＡＧ-３’反:５’-ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴ-３’983Ｂ型正:５’-ＧＡＧＡ