大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張誘導(dǎo)內(nèi)臟痛敏模型的建立及rpv1表達(dá)的影響

大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張誘導(dǎo)內(nèi)臟痛敏模型的建立及rpv1表達(dá)的影響

內(nèi)臟疼痛是一種慢性疼痛，內(nèi)臟疼痛是導(dǎo)致內(nèi)臟疼痛的最重要機(jī)制。它是內(nèi)臟疾?。ㄈ缪装Y性腸?。┖凸δ苣c病（如腸炎綜合征）的常見疾病。近年發(fā)現(xiàn),除炎性反應(yīng)性腸病外,功能性腸病腸壁也有炎性反應(yīng)存在,并發(fā)現(xiàn)這些腸病的腹痛和內(nèi)臟痛敏與瞬時(shí)感受器電位香草酸受體亞型1(transientreceptorpotentialvanilloid1,TRPV1)的表達(dá)程度有關(guān)。TRPV1是存在于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上的非選擇性陽離子通道蛋白,在人體中分布廣泛,除神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)外,在樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、白細(xì)胞以及胃、結(jié)腸等均有表達(dá),TRPV1的上調(diào)和敏感化可能與內(nèi)臟痛敏成正相關(guān)。樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、白細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的前體細(xì)胞均來自于骨髓細(xì)胞,骨髓細(xì)胞TRPV1的表達(dá)變化是否與內(nèi)臟痛敏有關(guān)值得探討。熱敏灸是指施灸熱敏腧穴治療時(shí)產(chǎn)生透熱、擴(kuò)熱、傳熱、局部不熱遠(yuǎn)部熱等現(xiàn)象的一種懸灸治療方法,一般施灸時(shí)間約40min,比其它灸法施灸時(shí)間長,療效較好。通過熱敏懸灸治療腹瀉型腸易激綜合征取得較好效果,患者高發(fā)熱敏穴區(qū)熱敏腧穴的分布在天樞、命門出現(xiàn)率較高,其次是在大腸俞、足三里、關(guān)元穴區(qū)。本研究以新生乳鼠結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectaldistension,CRD)制備腸易激綜合征內(nèi)臟痛敏模型,懸灸成年后大鼠熱敏腧穴“大腸俞”40min模擬熱敏灸,觀察鎮(zhèn)痛效應(yīng)與骨髓細(xì)胞TRPV1表達(dá)變化的關(guān)系,為進(jìn)一步探索熱敏灸的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1大鼠內(nèi)臟痛敏檢測(cè)SD大鼠由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。交配后所產(chǎn)雄性新生SD大鼠8~10只與其哺乳母鼠共同飼養(yǎng),自由飲食飲水,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組。鼠齡8周時(shí)對(duì)照組存活37只,模型組存活41只,都進(jìn)行內(nèi)臟痛敏檢測(cè)。隨機(jī)將其中28只鼠均分為對(duì)照組、模型組、艾灸對(duì)照組、艾灸模型組。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處理符合相關(guān)動(dòng)物使用倫理學(xué)原則。1.2試劑及儀器美國ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒SYBR?PremixExTaqTMⅡ(TaKaRa,大連寶生物工程有限公司),TrizolReagent購于Invitrogen公司,艾灸條由江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物科學(xué)研究部提供。1.3大鼠球囊擴(kuò)張參照文獻(xiàn)球囊擴(kuò)張刺激乳鼠直結(jié)腸制備腸易激綜合征內(nèi)臟痛敏模型方法。將出生8d的乳鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組與模型組。模型組在出生后第8~14天,用血管擴(kuò)張球囊(直徑2mm,長2cm)自大鼠肛門輕柔插入2~3cm,球囊充氣擴(kuò)張1min,維持壓力60mmHg(1mmHg≈0.133kPa),30min后重復(fù)擴(kuò)張刺激1min,每日1次,持續(xù)1周。對(duì)照組施予同樣時(shí)間的會(huì)陰部撫摸。完成上述刺激后直到乳鼠成年(8周以上),大鼠不再接受任何刺激。1.4crd擴(kuò)張和awr評(píng)價(jià)大鼠飼養(yǎng)8周后,對(duì)CRD誘發(fā)的腹部撤回反射(abdominalwithdrawalreflex,AWR)進(jìn)行半定量評(píng)分。實(shí)驗(yàn)前,禁食不禁水12h,以減少糞便形成,并于實(shí)驗(yàn)前輕觸肛門,使其排出殘余糞便。乙醚麻醉SD大鼠,在大鼠麻醉狀態(tài)下自肛門內(nèi)置入自制的CRD擴(kuò)張球囊,深度為6~8cm,并用膠帶將球囊導(dǎo)管固定于大鼠尾部。置大鼠于特制的籠巢內(nèi),以限制其活動(dòng),待大鼠蘇醒后30min,進(jìn)行CRD刺激,緩慢增加壓力至大鼠腹部剛出現(xiàn)抬起時(shí)的壓力值作為痛閾值,并進(jìn)行AWR評(píng)分。CRD分為20、40、60、80mmHg4個(gè)刺激等級(jí)。相應(yīng)的AWR評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Al-chaer的方法,具體如下:對(duì)CRD刺激無行為反應(yīng),評(píng)為0分;給予刺激大鼠有動(dòng)作,停頓后并見短暫的頭部運(yùn)動(dòng)行為,評(píng)為1分;刺激期間,見有腹部肌肉的收縮,評(píng)為2分;如有腹部抬起行為,評(píng)為3分;身體拱起,并抬起盆腔和陰囊者,評(píng)為4分。擴(kuò)張壓力的監(jiān)測(cè)通過1個(gè)三通管,連接擴(kuò)張球囊和臺(tái)式血壓計(jì)而實(shí)現(xiàn)。每次CRD刺激持續(xù)20s,間隔5min后給下一次刺激;每個(gè)刺激強(qiáng)度重復(fù)3次,取平均值作為最后的評(píng)分值和痛閾值。1.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)骨髓細(xì)胞“大腸俞”位于大鼠第4腰椎棘突旁開0.5cm。將艾灸各組大鼠置于特制大鼠固定器內(nèi)限制活動(dòng),將艾條固定于自制艾灸支架上,艾灸穴位孔直徑0.5cm,垂直距離大鼠單側(cè)“大腸俞”穴區(qū)約2cm,點(diǎn)燃施灸40min模擬熱敏灸,艾灸后進(jìn)行AWR評(píng)分及痛閾值測(cè)定;非艾灸組大鼠同樣置固定器內(nèi)限制活動(dòng),在靜置40min后進(jìn)行AWR評(píng)分及痛閾值測(cè)定。大鼠脫臼處死,無菌條件下取股骨和脛骨,沖洗髓腔,沖洗液離心獲取新鮮骨髓細(xì)胞,按照RNA提取試劑盒說明書用Trizol試劑抽提大鼠骨髓細(xì)胞總RNA。根據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,以mRNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩．a(chǎn)物cDNA應(yīng)用熒光定量試劑盒PremixExTaqTMⅡ在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行TRPV1mRNA檢測(cè),以GAPDH為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì):TRPV1上游序列為5’-GACATGCCACCCAG-CAGG-3’,下游序列為5’-TCAATTCCCACA-CACCTCCC-3’,擴(kuò)增片段大小為262bp;GAPDH上游序列為5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’,下游序列為5’-TTCAGCTCTGGGATGAC-CTT-3’,擴(kuò)增片段大小為155bp。PCR反應(yīng)體系20μL,包括SYBRGreenⅠ10μL,ROXⅡ0.4μL,10mmol/L的上下游引物各0.4μL,cDNA模板0.4μL,補(bǔ)充滅菌ddH2O至20μL。RT-PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s,95℃變性5s,60℃退火延伸34s,共40個(gè)循環(huán)。加樣時(shí),每一樣本和基因同時(shí)做1個(gè)相同的復(fù)孔,輸出數(shù)據(jù)為兩者的平均值,用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件RQStudy模塊分析熒光數(shù)據(jù),計(jì)算同一樣本內(nèi)目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量。1.7比較方法和樣本選擇數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組內(nèi)前后的比較選用配對(duì)t檢驗(yàn),兩組間比較選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用SNK檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1rt刺激痛閾值mmlpj,wt我們首先檢測(cè)新生乳鼠直結(jié)腸球囊擴(kuò)張刺激(模型組)在成年后是否有內(nèi)臟痛敏。結(jié)果顯示,模型組CRD刺激痛閾值[(31.77±10.64)mmHg]明顯低于對(duì)照組痛閾值[(58.76±18.92)mmHg,P<0.01],模型組在20、40、60、80mmHg各級(jí)CRD的AWR評(píng)分均明顯高于對(duì)照組(P<0.01),見圖1。表明新生乳鼠CRD刺激可形成成年內(nèi)臟痛敏。2.2艾日花旋轉(zhuǎn)主要有20、40、60、80mmlph,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,p,.大鼠懸灸40min表現(xiàn)為舒適不動(dòng)。模型組艾灸后痛閾值[(74.00±17.29)mmHg]明顯高于艾灸前[(27.19±7.00)mmHg,P<0.01],艾灸后在20、40、60、80mmHg的CRD刺激AWR評(píng)分均明顯低于艾灸前(P<0.01,P<0.05),見圖2。表明模擬熱敏灸對(duì)內(nèi)臟痛敏大鼠有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。2.3艾日壓力對(duì)aawr評(píng)分的影響在非傷害性CRD壓力20mmHg刺激時(shí),艾灸前與艾灸后AWR評(píng)分沒有明顯差異,但在傷害性CRD壓力40、60、80mmHg刺激時(shí),艾灸后AWR評(píng)分明顯低于艾灸前(P<0.01),見圖3。艾灸后痛閾值[(82.28±20.51)mmHg]也明顯高于艾灸前痛閾值[(48.10±6.73)mmHg,P<0.05],表明艾灸正常動(dòng)物“大腸俞”有增加內(nèi)臟痛耐受性和鎮(zhèn)痛作用。2.4兩組抑制率在半數(shù)據(jù)文件crd時(shí)的比較鎮(zhèn)痛效應(yīng)以抑制率表示,抑制率=(艾灸前AWR評(píng)分值-艾灸后AWR評(píng)分值)/艾灸前AWR評(píng)分值×100%。結(jié)果顯示,模型組抑制率在20mmHg的CRD時(shí)明顯高于對(duì)照組(P<0.01),而在40、60、80mmHg的CRD時(shí)兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4。表明在非傷害性CRD壓力刺激時(shí),模擬熱敏灸可明顯減輕模型組的內(nèi)臟痛敏而不明顯影響正常的基礎(chǔ)感受反應(yīng),但在傷害性CRD壓力刺激時(shí),模擬熱敏灸對(duì)內(nèi)臟痛敏動(dòng)物和正常動(dòng)物的傷害性感受反應(yīng)具有相同的抑制效應(yīng),均可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法大鼠在靜置40min后其AWR評(píng)分在20、40、60、80mmHgCRD刺激時(shí)與靜置前差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。痛閾值在靜置40min后[(43.18±23.40)mmHg]與靜置前[(43.60±3.42)mmHg]差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明固定器內(nèi)限制大鼠活動(dòng)靜置40min不影響CRD刺激反應(yīng),艾灸效應(yīng)不是由于短時(shí)限制活動(dòng)所造成的心理應(yīng)激所致。2.6各組trpvm1rna表達(dá)比較對(duì)照組TRPV1mRNA相對(duì)表達(dá)量較低,對(duì)照組艾灸后TRPV1mRNA相對(duì)表達(dá)量略有降低(P>0.05),模型組TRPV1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和艾灸對(duì)照組(P<0.01),艾灸模型組TRPV1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.01),見圖6。3熱敏紡單次給藥對(duì)內(nèi)臟痛、痛敏和cri水平裂率的影響用新生期大鼠給予結(jié)直腸擴(kuò)張刺激方法而建立的慢性內(nèi)臟痛敏模型的表現(xiàn)與臨床腸易激綜合征相類似,AWR評(píng)分在一定程度上能夠反映結(jié)直腸擴(kuò)張所致的內(nèi)臟傷害性刺激強(qiáng)度,可以作為判斷慢性內(nèi)臟痛敏模型是否成功的指標(biāo)。艾灸在緩解和消除疼痛,尤其是內(nèi)臟痛方面具有良好的療效,艾灸療法對(duì)腸易激綜合征療效確切;臨床上熱敏懸灸治療腹瀉型腸易激綜合征取得較好效果,大腸俞是患者高發(fā)熱敏穴區(qū)之一。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般艾灸時(shí)間在10~20min,而陳日新等研究表明在動(dòng)物熱敏穴區(qū)一般施灸時(shí)間約40min,并伴有尾部溫度升高,療效較好,因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中懸灸40min動(dòng)物表現(xiàn)舒適不動(dòng)的灸法可稱為模擬熱敏灸。我們觀察到,在慢性內(nèi)臟痛敏模型大鼠“大腸俞”單次模擬熱敏灸時(shí),灸后有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng),而且對(duì)對(duì)照組大鼠“大腸俞”單次模擬熱敏灸時(shí),在傷害性CRD壓力刺激時(shí)也有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng),表明艾灸正常動(dòng)物“大腸俞”對(duì)基礎(chǔ)痛感受和痛反應(yīng)也有影響,能增加內(nèi)臟痛耐受性和產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。模擬熱敏灸能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的神經(jīng)機(jī)制可能與“彌漫性傷害抑制性控制”(DNIC)有關(guān),DNIC構(gòu)成一個(gè)脊髓-脊髓上中樞-脊髓的神經(jīng)回路,整合來自外周的傷害性信號(hào),體表特定參數(shù)的熱灸樣刺激能夠很好地抑制內(nèi)臟傷害性反應(yīng),其作用機(jī)制很可能就是通過DNIC系統(tǒng)發(fā)揮痛的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。內(nèi)臟痛敏是引起內(nèi)臟痛的最主要機(jī)制,外周病理信息長期存在是重要原因,如炎性反應(yīng)性腸病時(shí)腸道上皮屏障被破壞,腸道免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)和錯(cuò)誤識(shí)別,激活機(jī)體的免疫應(yīng)答,炎性反應(yīng)被逐級(jí)放大,最終導(dǎo)致組織損傷,出現(xiàn)病理改變和臨床表現(xiàn)。腸易激綜合征患者腸道有低度的炎性反應(yīng),腸道肥大細(xì)胞的數(shù)量及表達(dá)存在異常,肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的多種生物活性介質(zhì)參與了腸易激綜合征的病理生理過程。由此可見,內(nèi)臟痛及痛敏的維持是需要外周炎性反應(yīng)的持續(xù)或反復(fù)存在,炎性反應(yīng)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的前體細(xì)胞均來自于骨髓干細(xì)胞,骨髓干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞(HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),HSCs可以持續(xù)地分化成各種造血前體細(xì)胞,進(jìn)而再分化成造血與免疫系統(tǒng)中的各類成熟的細(xì)胞。近來研究表明,感染、炎性反應(yīng)時(shí)HSCs通過toll-like受體直接感受病原體,細(xì)胞因子干擾素和腫瘤壞死因子可通過血液循環(huán)到達(dá)造血微環(huán)境直接調(diào)節(jié)HSCs功能,前炎性反應(yīng)細(xì)胞因子對(duì)維持基礎(chǔ)水平的HSCs數(shù)量和功能是重要的,炎性反應(yīng)對(duì)造血微環(huán)境的作用以及慢性炎性反應(yīng)長時(shí)間如何影響HSCs值得研究。炎性反應(yīng)除影響HSCs外,也可動(dòng)員BMSCs進(jìn)入血液循環(huán)。既然慢性炎性反應(yīng)與骨髓干細(xì)胞有關(guān),慢性痛也可能與骨髓干細(xì)胞有關(guān)。由于炎性反應(yīng)和內(nèi)臟痛敏都與TRPV1有關(guān),腸易激綜合征病人的腹痛程度與結(jié)腸TRPV1高表達(dá)有關(guān),炎性反應(yīng)性腸病腹痛病人和大鼠模型也有結(jié)腸TRPV1高表達(dá),這些疾病TRPV1的高表達(dá)是否與骨髓有關(guān)值得探討。我們的研究結(jié)果表明,新生期大鼠CRD刺激引起慢性內(nèi)臟痛敏,除出現(xiàn)明顯痛閾降低和傷害性運(yùn)動(dòng)反射評(píng)分